siRNA数据来自Huesken等^{[ 7]}针对31条mRNA全基因组随机设计的2431条siRNAs,这些siRNA数据给出了它们的靶标基因的cDNA序列、siRNA精确的干扰抑制效率。由于目前RNA二级结构预测软件主要是针对长度不大于800个核苷酸的RNA序列(长度超过了800个核苷酸,预测准确率会急剧降低),因此为了提高mRNA二级结构预测的准确性,这里选择了针对23条长度小于800个核苷酸的靶标mRNA的1682组数据(见表1)。这些数据的抑制率分布见图1,其中抑制率大于90%的有311条,小于50%有253条。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 siRNA数据库及其靶标mRNA Table 1 siRNA library and targeted mRNA mRNA 编号 长度 /bp siRNA 数目 mRNA 编号 长度 /bp siRNA 数目 1 623 67 16 391 78 2 607 57 18 389 79 3 344 78 20 400 79 4 420 79 21 454 79 5 511 76 22 564 79 9 362 53 23 454 74 10 449 70 29 351 75 11 374 64 30 286 75 12 575 79 31 542 75 13 397 72 32 579 71 14 450 70 33 300 76 15 529 77

表1 siRNA数据库及其靶标mRNA Table 1 siRNA library and targeted mRNA

图1

Fig.1

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	图1 siRNA抑制率的分布Fig.1 Distribution of siRNA inhibition ratio

利用维也纳RNA软件包提供的RNAup WebServer来预测RNA-RNA结合热力学特征,通过输入siRNA序列和靶标mRNA(长度小于800 bp)即可得到打开靶标结合位点的能量Δ G_m和打开siRNA的能量Δ G_s以及siRNA与mRNA结合所释放出来的能量Δ G_d。则可得siRNA与mRNA结合的总自由能Δ G_t=Δ G_m+Δ G_s+Δ G_d。

本文中,共提取了与siRNA抑制效率密切相关的34个特征,主要分为以下3种:

(1)常规的siRNA序列特征,见表2,如siRNA的G/C含量、UI-Tei等^{[ 3]}提出的4个哺乳动物siRNA设计法则等。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 常规siRNA序列特征提取方法 Table 2 General siRNA sequence feature extraction method 特征标识 特征提取方法 G/C含量 siRNA中G和C所占比例(0~1) U-T1 反义链5'端为A/U(满足为1,不满足为0) U-T2 正义链5'端为G/C(满足为1,不满足为0) U-T3 在反义链5'末端三分之一富含AU(满足为1,不满足为0) U-T4 不存在连续超过9位的GC区(满足为1,不满足为0) A U-T法则全满足:U-T1、U-T2、U-T3、U-T4均为1,则该特征值为1,否则为0 N U-T法则全不满足:U-T1、U-T2、U-T3、U-T4均为0,则该特征值为1,否则为0

表2 常规siRNA序列特征提取方法 Table 2 General siRNA sequence feature extraction method

(2)本文提出的3-mer编码序列特征,见表3,对siRNA进行重新编码提取出的3-mer序列特征20个,提取方法见图2,对siRNA进行两次重新编码提取出的20个3-mer序列特征,其中M代表碱基C/U,N代表碱基G/A;P代表碱基G/C,Q代表碱基A/U。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 3-mer编码序列特征提取方法 Table 3 3-mer coding sequence feather extraction methods 特征标识 特征提取方法 L1~L4 L1、L2、L3、L4分别为第一次3-mer编码中AAA,UUU,GGG,CCC出现的个数(值的分布为0~4) S1~S8 S1至S8代表第二次重新编码后8种不同3-mer(由M、N组成,23种组合)组合出现的个数 K1~K8 K1至K8分别代表第二次重新编码后8种不同3-mer(P、Q组成,23种组合)组合出现的个数

表3 3-mer编码序列特征提取方法 Table 3 3-mer coding sequence feather extraction methods

图2

Fig.2

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	图2 对siRNA(编号为19546)进行重新编码提取出的20个3-mer序列特征Fig.2 Extracted 20 features of 3-mer motif from recoding siRNA(No.19546)

(3)siRNA与靶标mRNA相互作用的热力学特征以及靶标的热力学特征,见表4。该特征为本研究首次应用到siRNA干扰效率的预测领域。这些包括RNAup预测的4个热力学特征Δ G_t、Δ G_m、Δ G_s以及Δ G_d,siRNA结合区域的位置P,其中P为第一个与siRNA结合的碱基的位置(从mRNA5'端记起)与mRMA长度的商。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 siRNA-mRNA结合热力学特征提取方法 Table 4 siRNA-mRNA binding thermodynamics feather extraction methods 特征标识 特征提取方法 Δ Gt siRNA与mRNA结合的总自由能 Δ Gt=Δ Gm+Δ Gs+Δ Gd(单位4.1868 kJ/mol) Δ Gm 打开靶标结合位点的能量(单位4.1868 kJ/mol) Δ Gs 打开siRNA的能量(单位4.1868 kJ/mol) Δ Gd siRNA与mRNA结合所释放出来的能量(单位4.1868 kJ/mol) P 第一个与siRNA结合碱基的位置(从mRNA5'端记起)与mRMA长度的商(值为0~1) W 靶标mRNA形成二级结构没有发生互补配对的个数 M 靶标mRNA形成二级结构所释放的能量(单位4.1868 kJ/mol)

表4 siRNA-mRNA结合热力学特征提取方法 Table 4 siRNA-mRNA binding thermodynamics feather extraction methods

按照上述特征提取方法提取了所有1682组数据的全部特征信息,然后进行下一步支持向量机的数据学习训练。

LIBSVM^{[ 8, 9]}的版本号为2.86-1,将1682组样本siRNA中抑制率大于89.5%的325组作为阳性样本,将小于54.9%的382组作为阴性样本,样本集大小为707。将样本的34个特征值输入到LIBSVB中,随机抽取500个作为训练集,剩下207作为测试集。采用交叉验证的方法在一定范围内寻找最佳参数 -c与 -g。重复训练10次取平均值。

本文采用五次交叉验证来寻找LIBSVM分类器的最优参数,每次实验都随机选取测试集和样本集,最后取10次实验平均值。分别计算出分类器的Accurary,Sensitivity,Specificity,MCC和Precision值:

式中:TP代表分类器预测结果中真阳性的数目;TN打表真阴性的数目;FP代表假阳性的数目;FN代表假阴性的数目。

分类器的评价实际上就是对预测效果的评估。由式(1)~(5)可以看出,敏感度实际上就是真阳性率;特异性衡量的是该模型预测对个体特异性变化的应变能力。准确度就是预测正确的比例。这些参数能够很好地评测分类器的好坏^{[ 10]}。

从表5可以看出,本文提取的20个3-mer编码特征和7个siRNA-mRNA结合热力学特征再加上7个常规的siRNA序列特征可以很好地进行高效siRNA分类筛选,分类器的预测准确率达到了88.12%,敏感度和特异性分别为88.35%和87.94%,MCC值为0.7609,Precision值为0.8593,通过对照实验(见表6)可以看出随着3-mer编码特征和siRNA-mRNA结合热力学特征的加入,分类器预测的准确率分别提高了6.19%和3.1%。并且分类器的其他评测参数也均有不同程度的提高,说明本文提出的siRNA-mRNA结合热力学特征和3-mer编码特征对siRNA干扰效率的预测是有效的。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 所有34个特征进行十次SVM训练得到的分类器的表现 Table 5 Classifier performance after 10 times SVM training of all 34 features 训练次数 FN FP TP TN 准确度/% 敏感度/% 特异性/% MCC 精度 1 10 11 82 104 89.86 89.13 90.43 0.7948 0.8817 2 8 14 83 102 89.37 91.21 87.93 0.7872 0.8557 3 13 12 93 89 87.92 87.74 88.12 0.7584 0.8857 4 11 17 81 98 86.47 88.04 85.22 0.7291 0.8265 5 12 15 88 92 86.96 88.00 85.98 0.7394 0.8544 6 12 16 74 105 86.47 86.05 86.78 0.7239 0.8222 7 10 16 87 94 87.44 89.69 85.45 0.7500 0.8447 8 11 14 77 105 87.92 87.50 88.24 0.7543 0.8462 9 9 12 79 107 89.86 89.77 89.92 0.7937 0.8681 10 14 9 89 95 88.89 86.41 91.35 0.7786 0.9082 均值 - - - - 88.12 88.35 87.94 0.7609 0.8593

表5 所有34个特征进行十次SVM训练得到的分类器的表现 Table 5 Classifier performance after 10 times SVM training of all 34 features

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 不同特征集分类器的表现 Table 6 Classifer performance of different characteristic sets 分类器 准确度/% 敏感度/% 特异性/% MCC 精度 所有34个特征 88.12 88.35 87.94 0.7609 0.8593 没有3-mer编码特征 81.93 77.30 86.28 0.6397 0.8388 没有siRNA-mRNA结合自由能特征 85.02 82.29 87.38 0.6985 0.8494

表6 不同特征集分类器的表现 Table 6 Classifer performance of different characteristic sets

目前,siRNA的设计主要有两种方法,分别是基于序列特征和基于热力学能量特征。基于序列特征的siRNA设计方法是以有效的siRNA序列特征为依据,利用统计学方法计算获得设计规则。传统的siRNA设计软件存在如下问题:①选取的样本集不同,有些方法的样本容量偏小,得到的设计规则通用性较差;②选择的特征集存在差异,得出的设计规则不尽相同,有些甚至是相悖的,缺乏统一的标准;③缺乏对特定领域的特征分析,如没有针对特定基因的GC含量特征、内部重复序列特征分析,各特征之间是独立分析的,预测精度不高,一般在50%~70%;④没有考虑脱靶效应。

从本文实验结果和对分类器的内部评估可以看出,本文方法效果较理想。文献^{[ 2]}是本课题组2010年的研究成果,准确度为81.1%,加入本文所提的两类特征之后,分类器的预测准确度提高到88.12%。为了进一步证实本文所提出的方法真实有效,还选取了Zhi John Lu和David H.Mathews2007年的一项研究成果^{[ 6]}作为对比,见表7。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 本文方法与文献[6]方法的结果对比 Table 7 Result comparision between reference[6] and proposed method 准确度/% 敏感度/% 特异性/% 文方法 88.12 88.35 87.94 文献[6]方法 87.60 22.70 96.50

表7 本文方法与文献[6]方法的结果对比 Table 7 Result comparision between reference[6] and proposed method

从表7可以看出,两种方法的准确度相差不大,但是在敏感度方面,本文方法有较大的优越性,从敏感度的值88.35%可以看出,本文方法更接近于真实情况,真阳性率比较高。但在特异性方面,文献^{[ 6]}中方法高了8个百分点,两种方法各有优缺点。