MS液体培养基室温摇床上培养21 d的CS-RNAi人参发根,本实验室于2011年5月份构建并保存^{[ 6]};达玛烯二醇标准品、环阿乔醇标准品购于ChromaDex(US);人参皂苷Rg1、Re、Rb1标准品购于中国药品生物制品检验所;氯仿、甲醇、甲醛、乙腈、香草醛等试剂购于北京鼎国生物技术有限责任公司。

1.2.1 人参发根中环阿乔醇和达玛烯二醇的提取及含量测定^{[ 4]}

采用色谱甲醇溶解环阿乔醇和达玛烯二醇标准品,并配成1 mg/ml的标准品溶液,将两种标准品溶液分别稀释至不同浓度,采用高效液相色谱法(HPLC)分别对其含量进行检测,并以标准品质量为横坐标(μg),峰面积(mAu×min)为纵坐标分别绘制标准曲线。

取MS液体培养基培养21 d的人参发根,经蒸馏水洗净后,液氮冷冻研磨成粉末,分别加入装有5 ml乙酸酐(用于提取环阿乔醇)和5 ml色谱甲醇(用于提取达玛烯二醇)的离心管中,经超声提取,离心,取上清液,并经旋转蒸发获得浓缩物,分别以少量乙酸酐和色谱甲醇溶解并定容至1 ml。采用薄层层析(TLC)法分别对其分离,展开剂为氯仿∶甲醇=30∶1,在365 nm紫外灯下显色,并刮取相应半点,分别用300 μl乙腈溶解,过膜,经HPLC法计算环阿乔醇和达玛烯二醇的含量。

1.2.2 人参发根中总固醇的提取及含量测定^{[ 7]}

采用以乙酸酐法对人参发根的总固醇含量进行分析。以不同浓度的植物总固醇标准品在650 nm处的吸光度 A为横坐标,不同浓度的植物总固醇标准品含量(mg/ml)为纵坐标绘制标准曲线。

准确称取2 g人参发根粉末加入装有5 ml乙酸酐的离心管中,经超声提取(40 ℃,40 kHz,45 min),过滤,经旋转蒸发得到浓缩物,用少量乙酸酐溶解并定容至1 ml,以浓硫酸为显色剂,使用紫外分光光度计在650 nm处测定吸光度,每个样品测定重复3次,取平均值作为试验结果。

1.2.3 人参发根总皂苷的提取及含量测定^{[ 8]}

(1)人参发根中总皂苷的提取

准确称取人参发根粉末1.0 g,以70%乙醇为溶剂提取(料∶液=1∶10),于摇床(25 ℃,100 r/min)浸提24 h,经超声波提取30 min(40 kHz,40 ℃),提取液经旋转蒸发得到浓缩物,以色谱甲醇为溶剂溶解并定容至10 ml,过膜备用。

(2)Re标准曲线的绘制

以5%香草醛-高氯酸比色法测定人参总皂苷含量^{[ 8]},分别准确量取Re标准品溶液(1 mg/ml)0.015、0.030、0.045、0.060、0.075、0.090 mL,加到10 ml具塞试管中。水浴挥发掉溶剂后,分别向6个试管中加入5%香草醛-冰醋酸0.2 ml,高氯酸0.8 ml,振荡混匀。60 ℃水浴加热15 min,取出迅速冰浴10 min,各试管分别加入5 ml冰醋酸,摇匀。随行试剂空白,在紫外分光光度计544 nm波长处测定吸光度 A,以吸光度 A为纵坐标,质量(mg)为横坐标绘制标准曲线,并进行回归分析。

(3)人参发根总皂苷含量的测定

以5%香草醛-高氯酸比色法测定人参总皂苷含量。向待测试样中加入5 ml冰醋酸,摇匀后用紫外分光光度计在波长544 nm测定样品吸光度。每个试样重复测定3次取平均值为试验结果。

1.2.4 人参发根中3种单体皂苷(Rg1、Re、Rb1)含量的测定

采用HPLC法对人参发根中3种单体皂苷(Rg1、Re、Rb1)含量进行检测^{[ 9]},HPLC检测条件如下,色谱柱:C18 ODS;流动相:乙腈(A)和0.05%磷酸水溶液(B);流速:0.8 ml/min;检测波长:203 nm;柱温:40 ℃;进样量:10 μl;采用梯度洗脱,试样含量采用峰面积归一法定量。

采用HPLC法分别检测环阿乔醇和达玛烯二醇的含量,其标准曲线如 图1所示,并利用该标准曲线计算待测试样的含量,结果如 表1所示。

由 表1可知,在CS-RNAi转化的人参发根中,环阿乔醇被极显著地抑制,含量仅为5.1367±1.3757 μg/g,证明本试验成功干扰了人参中CS基因的表达;CS-RNAi转化的人参发根中,达玛烯二醇含量显著高于对照组中达玛烯二醇的含量,达到124.5278±11.3319 μg/g,含量提升了20.98%,CS基因的RNA干扰促进了人参发根中达玛烯二醇的生物合成。

图1

Fig.1

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	图1 环阿乔醇和达玛烯二醇标准曲线Fig.1 Standard curve of cycloartenol and dammarenediol

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 人参发根中环阿乔醇和达玛烯二醇含量 Table 1 Content of cycloartenol and dammarenediol in ginseng hairy roots CK/(μg·g-1) CS-RNAi/(μg·g-1) 环阿乔醇 21.6057±1.3894 5.1367±1.3757 达玛烯二醇 102.9325±10.4972 124.5278±11.3319

表1 人参发根中环阿乔醇和达玛烯二醇含量 Table 1 Content of cycloartenol and dammarenediol in ginseng hairy roots

图2

Fig.2

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	图2 植物固醇标准曲线图Fig.2 Standard curve of plant sterols

采用以乙酸酐法对人参发根的总固醇含量进行分析。以不同浓度的植物总固醇标准品在650 nm处的吸光度 A为纵坐标,不同浓度的植物总固醇标准品含量(mg/ml)为横坐标绘制标准曲线。植物总固醇的标准曲线和回归方程如 图2所示。利用该标准曲线分别计算CS-RNAi组和对照组人参发根中总植物固醇的含量,对照组和CS-RNAi组干扰发根中总植物固醇含量分别为247.30±0.24、117.54±0.39 mg/g。

CS基因的RNA干扰对人参发根中总植物固醇含量有较大影响。在CS-RNAi组中,总植物固醇含量有明显的下降,抑制率为52.47%,结果表明,环阿乔醇合成酶是人参中植物固醇合成途径中的关键酶。

采用以5%香草醛-高氯酸比色法对人参发根的总皂苷含量进行分析。其标准曲线和回归方程如 图3所示,利用该标准曲线分别计算CS-RNAi组和对照组人参发根的总皂苷的含量。

图3

Fig.3

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	图3 总皂苷测定中Re标准曲线图Fig.3 Standard curve of saponins Re.

对照组的总皂苷含量仅为16.32±0.27 mg/g;在CS-RNAi组中,总皂苷含量有显著提高,为29.73±0.08 mg/g,增长了82.17%。该结果表明,CS基因的RNA干扰对人参总皂苷含量的提高有极显著的促进作用,这对调节人参发根中人参总皂苷的合成有着重大的积极作用,即通过对环阿乔醇合成酶的抑制,使2,3-氧化角鲨烯代谢流更多地流向人参皂苷合成途径,进一步促进人参皂苷的生物合成。

采用HPLC法分别检测CS基因RNA干扰的人参发根和对照组人参发根中Rg1、Re和Rb1的含量。其中单体皂苷Rg1、Re和Rb1标准曲线和回归方程如 图4所示。利用相应标准曲线分别计算CS-RNAi组和对照组人参发根中单体皂苷Rg1、Re和Rb1的含量,结果如 图4所示。

由 图4可知,与对照组中单体皂苷Rg1、Re、Rb1的含量结果相比,CS-RNAi干扰组即CAS基因RNA干扰转化的人参发根系中单体皂苷Rg1、Re、Rb1的含量均有显著提高,其中Rg1的含量为3.652257±0.03757 mg/g,比对照组2.349816±0.137219提高了55.43%;Re的含量为1.986733±0.12374 mg/g,比对照组1.437783±0.431815提高了38.18%;Rb1的含量为0.997865±0.173247 mg/g,比对照组0.825536±0.601130提高了20.87%。该结果表明,实现了促进人参中单体皂苷合成的正向调节;同时,本研究结果表明了RNA干扰技术运用于对植物次生代谢调节的可行性。

图4

Fig.4

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	图4 单体皂苷Rg1、Re和Rb1的标准曲线图Fig.4 Standard curve of Rg1、Re and Rb1