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梁彦龙, 赵寿经, 王倩, 李梦婷, 林曦, 窦博. Triton X-100对人参发根皂苷分泌和合成的影响.吉林大学学报:工学版, 2016, 46(3): 1013-1016
LIANG Yan-long, ZHAO Shou-jing, WANG Qian, LI Meng-ting, LIN Xi, DOU Bo. Effects of Triton X-100 on ginsenoside secretion and biosynthesis in Panax ginseng hairy roots. Journal of Jilin University Engineering and Technology Edition, 2016, 46(3): 1013-1016  
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Triton X-100对人参发根皂苷分泌和合成的影响
梁彦龙, 赵寿经, 王倩, 李梦婷, 林曦, 窦博
吉林大学 生命科学学院,长春 130012

作者简介:梁彦龙(1977-),男,副教授,博士.研究方向:生物工程.E-mail:liangyl@jlu.edu.cn

基金:“863”国家高技术研究发展计划项目(2013AA102604-3); 吉林大学创新实验项目(2014A45170)
摘要

研究了促渗透剂Triton X-100对人参发根皂苷分泌的影响,结果表明:质量分数为2%的Triton X-100可以有效促进人参皂苷的分泌,同时也能增强发根人参皂苷的生物合成量。此外,在Triton X-100作用下,人参皂苷生物合成关键酶基因达玛烯二醇合成酶基因的表达得到了增强。

关键词: 生物化学工程; 人参发根; 人参皂苷; Triton X-100; 分泌
中图分类号:Q815 文献标志码:A 文章编号:1671-5497(2016)03-1013-04
Effects of Triton X-100 on ginsenoside secretion and biosynthesis in Panax ginseng hairy roots
LIANG Yan-long, ZHAO Shou-jing, WANG Qian, LI Meng-ting, LIN Xi, DOU Bo
College of Life Sciences,Jilin University,Changchun 130012,China
Abstract

The effects of the penetrant Triton X-100 on the secretion of ginsenosides in Panax ginseng hairy roots were studied. Results show that Triton X-100 can effectively promote the secretion of ginsenosides and enhance the biosynthesis of ginsenosides in the hairy root. Moreover, under the presence of Triton X-100, the expression of dammarenediol synthase gene, the key gene in ginsenoside biosynthesis, is also elevated.

Keyword: biochemical engineering; panax ginseng hairy roots; ginsenoside; Triton X-100; secretion
0 引 言

人参是重要的药用作物, 但是人参种植的周期长、受季节条件影响大、对土壤条件要求严格、采用伐林栽参的方法对环境破坏较大。因此, 人们一直希望通过生物技术来解决这些问题。目前, 国内外研究人员尝试了各种生物技术手段, 试图通过非栽培途径来生产人参皂苷, 包括人参细胞培养、愈伤组织培养、人参发根培养[1, 2, 3]。其中, 由发根农杆菌介导的人参发根, 生长速度快、具有生物合成和遗传稳定性、容易培养, 被认为是生产皂苷最具潜力的生物技术手段[4, 5, 6, 7]。但是人参发根的皂苷是在发根内积累, 不分泌到培养基中, 而人参皂苷的体内积累会限制人参皂苷的生物合成和产量。此外, 也不能采用半连续或连续发酵手段来提高生产效率。近几年来, 已有一些报道表明可以通过化学或物理促渗透手段, 使植物组织细胞中的有效物质, 特别是次生代谢产物释放到培养基中[8]。因此, 本文研究了促渗透剂Triton X-100对人参发根皂苷分泌和生物合成的影响。

1 材料及方法
1.1 发根培养

人参发根是经本实验室诱导并在固体1/2 MS培养基上进行代传保存。人参发根的液体培养采用100 ml 1/2 MS培养基(含3%蔗糖), 在转速为120 r/min, 温度为28 ℃, 黑暗条件下培养。

1.2 促渗透

将培养两周的发根接种到液体1/2 MS培养基中, 并加入质量分数为2%的Triton X-100。对照实验组中的发根培养基不加入Triton X-100, 而是加入等量的蒸馏水。每组均做3次平行实验后取平均值。

1.3 人参皂苷含量分析

人参总皂苷和单体皂苷含量分析(Rg1、Re和Rb1)采用文献[9]的方法。

1.4 基因表达分析

由于达玛烯二醇合成酶是人参皂苷合成的关键酶[10], 所以采用了qPCR手段, 依据本课题组所报道的方法, 进行达玛烯二醇合成酶基因的表达分析[9]。人参发根总RNA分离提取采用RNAiso Reagent, 依据附带的说明书操作。引物设计为:5'-GAC ACC ACA TAC CAA CAA GA-3'和5'-CCG ATT TAT TAT TTA TTT GAG AG-3'。表达数据分析采用比较CT法。

2 结果及讨论
2.1 Triton X-100对发根生长的影响

将培养两周的发根接种到液体1/2 MS培养基中, 并加入质量分数分别为1%、2%、3%、4%的Triton X-100, 培养30天后测定发根干重, 以考查不同质量分数的Triton X-100对人参发根生长的影响, 每组做3次平行实验取平均值, 对照实验组发根不加入Triton X-100。由图1可以看出:随着质量分数的增加, Triton X-100对人参发根的生长有较强的抑制作用。质量分数为1%和2%的Triton X-100对发根的生长影响不大, 考虑到质量分数越高促渗透作用越强, 选取了质量分数为2%的Triton X-100进行后续实验, 并详细研究了质量分数为2%的Triton X-100作用下发根的生长曲线, 结果如图2所示。从图2可以看出, 质量分数为2%的Triton X-100对发根生长还是有轻微的抑制作用。

图1 不同质量分数的Triton X-100对人参发根生长的影响Fig.1 Effects of Triton X-100 at different concentrations on growth of hairy roots

图2 质量分数为2%的Triton X-100作用下发根的生长曲线Fig.2 Growth curve of Triton X-100 treated hairy roots

2.2 Triton X-100对发根皂苷的影响

把培养2周的人参发根1.5 g放入新鲜的100 ml 1/2 MS液体培养基中, 考查促渗透剂Triton X-100对人参发根皂苷的分泌诱导作用, 结果如图3所示。由图3可见:与对照组相比, Triton X-100处理的发根的皂苷大部分都分泌到培养基中。培养30天后对照发根的皂苷分泌比率为3.93%, 而经Triton X-100处理的发根皂苷分泌比率为77.35%, 而且Triton X-100发根培养体系的总皂苷质量分数大量增加, 约为对照组的2.45倍。可见Triton X-100不但可以促进发根皂苷分泌, 而且可以促进皂苷的生物合成。皂苷合成量的提高可能是因为皂苷分泌到细胞外, 从而减轻了反馈阻抑作用。

由图4可见, 经Triton X-100处理的发根在形态上与对照组没有明显区别, 只是发酵液颜色较深, 可能是由于细胞渗透性提高导致细胞内物质的释放所致。

图3 Triton X-100对人参皂苷分泌和合成的影响Fig.3 Effects of Triton X-100 on ginsenoside secretion

图4 培养25天的发根形态图Fig.4 Morphological images of hairy roots cultured for 25 days

2.3 皂苷合成关键酶基因的表达分析

图5 Triton X-100对达玛烯二醇合成酶 基因表达的影响Fig.5 Effects of Triton X-100 on expression of dammarenediol synthase gene

在不同生长时间, 用q-RT-PCR测定了在Triton X-100作用下达玛烯二醇合成酶基因相对于对照组发根的表达强度, 结果如图5所示。由图5可以看出:经Triton X-100处理的发根的相对表达强度均大于1, 说明在Triton X-100作用下, 人参皂苷合成关键酶基因达玛烯二醇合成酶基因的表达量均有提高, 这是Triton X-100能增强皂苷合成的内在原因。

3 结 论

考查了促渗透剂Triton X-100对人参发根皂苷分泌的影响, 结果表明, 培养基中加入质量分数为2%的Triton X-100可以诱导人参皂苷大量分泌到培养基中, 分泌率达70%以上, 同时, 皂苷的总生物合成量提高到2倍以上。在Triton X-100作用下, 皂苷合成关键酶基因达玛烯二醇合成酶基因的表达量有所增强, 这是Triton X-100可增强皂苷合成的内在原因。皂苷分泌到体外, 可以为人参发根生产皂苷的连续化发酵研究打下基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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