引用本文
徐梦蕾, 高宇, 刘静波, 熊晋锋, 赵颂宁, 黄延军. 基于抗氧化的大豆异黄酮对PC12细胞的神经保护作用. 2017, 47(1): 332-336
XU Meng-lei, GAO Yu, LIU Jing-bo, XIONG Jin-feng, ZHAO Song-ning, HUANG Yan-jun. Neuroprotective effects of soy isoflavones on PC12 cells based on antioxidation. Journal of Jilin University Engineering and Technology Edition, 2017, 47(1): 332-336  
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基于抗氧化的大豆异黄酮对PC12细胞的神经保护作用
徐梦蕾1, 高宇2, 刘静波1, 熊晋锋3, 赵颂宁1, 黄延军1
1.吉林大学 营养与功能食品实验室,长春 130062
2.吉林农业大学 农学院,长春 130118
3.长春生物制品研究所有限责任公司,长春 130012
通讯作者:刘静波(1962-),女,教授,博士生导师.研究方向:营养与功能食品.E-mail:ljb168@sohu.com

作者简介:徐梦蕾(1988-),女,博士研究生.研究方向:营养与功能食品.E-mail:xuml13@mails.jlu.edu.cn

基金:国家科技支撑计划项目(2012BAD33B03); 吉林大学研究生创新基金项目(2015052); 吉林农业大学科研启动基金项目(2015010).
摘要

实验研究了20.00 μg/mL的单一染料木黄酮(GEN)、大豆黄素(DAI)及其混合溶液(GEN-DAI)对PC12细胞的存活率、形态、线粒体膜电位以及超氧化物歧化酶活力和抑制率的影响。结果表明:3种溶液对上述指标均没有显著影响,但GEN提高了活性氧水平,相对荧光强度和丙二醛含量有所升高;DAI和GEN-DAI溶液显著地降低了乳酸脱氢酶漏出率,谷胱甘肽含量分别增加到(297.27±9.47) μmol/(g·prot)、(269.90±0.00) μmol/(g·prot);GEN-DAI混合溶液综合增强了胆碱系统的代谢,提高了乙酰胆碱含量。GEN-DAI混合溶液比两种单一组分溶液能够更有效地提高PC12细胞抗氧化系统活力。

关键词: 食品加工技术; PC12细胞; 大豆异黄酮; 抗氧化; 神经保护作用; 染料木黄酮; 大豆黄素
中图分类号:TS201 文献标志码:A 文章编号:1671-5497(2017)01-0332-05
Neuroprotective effects of soy isoflavones on PC12 cells based on antioxidation
XU Meng-lei1, GAO Yu2, LIU Jing-bo1, XIONG Jin-feng3, ZHAO Song-ning1, HUANG Yan-jun1
1.Laboratory of Nutrition and Functional Food, Jilin University, Changchun 130062, China
2.College of Agriculture, Jilin Agricultural University, Changchun 130018, China
3.Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd., Changchun 130012, China
Abstract

Experiment results show that when PC12 cells were exposed to 20.00 μg/mL genistein (GEN), daidzein (DAI) or their combination (GEN-DAI), the cells' viability rates, mophologies, mitochondrial membrane potential, superoxide dismutase activities and inhibition rates were not changed. However, different changes of PC12 cells were observed under different treatments. The reactive oxygen species level, the relative fluorescence intensity and malondialdehyde of PC12 cells were increased by GEN. The leakage rate of lactic dehydrogenase was decreased in DAI and in GEN-DAI combination treatments, the glutathione contents were increased to (297.27±9.47) μmol/(g·prot) and (269.90±00) μmol/(g·prot) respectively. The acetylcholine content in culture medium and metabolism of cholinergic system was increased in GEN-DAI treatment. GEN-DAI combination treatment can more significantly increase the activity of the antioxidant system of PC12 cells than GEN and DAI treatments.

Keyword: food processing technology; PC12 cells; soy isoflavones; antioxidant; neuroprotective effect; genistein; daidzein
0 引 言

大豆异黄酮是豆科植物的一类植物次生代谢物, 主要贮存在液泡或者细胞壁中[1]。已经发现的大豆异黄酮有15种, 染料木黄酮(Genistein, GEN, 又称染料木素、金雀异黄素)和大豆黄素(Daidzein, DAI, 又称黄豆黄素-I、大豆苷元)在大豆籽粒中占80%~95%[2]。它们以游离型(苷元)、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷和琥珀酰苷5种形式存在, 其中以葡萄糖苷型和丙二酰基葡萄糖苷两种形式居多, 琥珀酰形式在大豆的发酵形式— — 纳豆中发现[3]。

大豆异黄酮在神经保护作用上的研究成为热点。GEN在蒙古沙鼠脑模型中有很强的神经保护作用[4]。在胚胎鼠原代皮层神经元类似缺血性的损伤中, GEN可以有效地阻止β -淀粉样蛋白引起的炎症反应, 达到保护神经的作用[5]。DAI也有神经保护的作用, 并且可以减少缺血及再灌注导致的损伤[6]。这些研究都是针对单一的成分进行的, 但实际上, 往往混合的成分有更好的功能性, 使实验结果完全不同。动物实验中DAI和GEN的混合物(含量同豆粉中的比例相同)会加快乳腺肿瘤的生长; 豆粉却有抑制肿瘤的作用[7]。这些都说明各组分在联合时产生的作用可能完全不同于单个物质本身, 使整体具有部分所不具有的功能性。目前, 很少有文献报道不同大豆异黄酮对神经细胞的作用, 因此有必要研究大豆异黄酮单独组分及其混合物对神经细胞的作用。

PC12细胞是一种来自大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的克隆细胞系, 作为类神经元细胞, 经常用于多巴胺能的神经细胞模型以及神经系统疾病的体外研究[8]。本文以PC12细胞作为神经细胞模型, 研究了GEN、DAI及其混合溶液对PC12细胞的影响。从细胞形态、数量、抗氧化防御系统(包括抗氧化酶及非酶抗氧化物质)、培养液中乙酰胆碱(ACh)含量以及线粒体膜电位变化等方面, 探讨了不同大豆异黄酮溶液对PC12细胞的作用机理。

1 材料与方法
1.1 原料

实验室自有大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12细胞); 染料木黄酮(GEN, 质量分数为99%)、大豆黄素(DAI, 质量分数为99%)、2', 7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA, 质量分数为97%)和二甲基亚砜(DMSO, 质量分数为99%)购自Sigma-Aldrich公司; DMEM-低糖培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)和质量分数为0.25%EDTA型胰酶购自美国Gibco公司; MTS单溶液细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司; 青霉素链霉素溶液(双抗)购自美国HyClone公司; 乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒、总谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司; 超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器和设备

主要仪器和设备有AG-204型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)、DW-86L288型超低温保存箱(青岛海尔股份有限公司)、Bio Tek Synergy HT型多功能酶标仪(美国博腾仪器有限公司)、BDS-300倒置生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)、FV1000型激光共聚焦扫描显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂配制方法

GEN、DAI粉末溶于DMSO中, 用蒸馏水稀释, 使DMSO质量分数小于0.1%, 保存于4 ℃冰箱备用。DCFH-DA粉末溶于DMSO中, 摩尔浓度为10 mM/L, 贮存于-20 ℃备用, 使用前用DMEM稀释[9]。

1.3.2 细胞培养、形态观察及存活率计算方法

将PC12细胞(1× 105 个/mL, 800 μ L/孔)种入24孔板, 37 ℃恒温培养24 h后分别暴露于200 μ L/孔GEN溶液、DAI溶液、GEN-DAI混合溶液(质量浓度均为20.00 μ g/mL), 其中阳性对照组质量浓度为0.00 μ g/mL; 再培养24 h后用显微镜观察形态。细胞数量的测定方法为培养结束后加入200 μ L/孔MTS试剂, 利用酶标仪测定其在490 nm处的吸光度, 计算细胞存活率。

1.3.3 抗氧化功能指标的测定方法

按照1.3.2节中方法完成细胞培养后, 利用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒测定LDH漏出率, 计算公式如下:

LDH漏出率-1=LDH释放LDH细胞内×100%(1)

LDH漏出率-2=LDH释放LDH释放+LDH细胞内×100%(2)

用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞蛋白浓度, 再用细胞丙二醛(MDA)测定试剂盒(微板法)测定MDA含量, 超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法试剂盒测定总SOD活力、SOD活力的抑制率, 总谷胱甘肽检测试剂盒测定GSH含量。

1.3.4 细胞相对荧光强度(RFI)、细胞液ACh含量的测定及线粒体膜电位观察方法

按照1.3.2节方法培养细胞, 吸弃各孔上清, 加入DCFH-DA溶液(10 μ M/L), 恒温孵育15 min, 吸弃上清液, 用DMEM培养基润洗, 再加入DMEM培养基[10]。酶标仪测定荧光强度(激发:485/20; 发射:528/20), 并测定OD490值, 比值为RFI。按照1.3.2节培养细胞后, 利用乙酰胆碱测定试剂盒测定培养液内ACh含量; 用膜电位检测试剂盒(JC-1)染色, 激光共聚焦扫描显微镜观察。

1.3.5 统计学处理

试验数据采用SPSS 16.0软件统计分析, 组间比较采用Duncan氏新复极差法(SSR)。

2 结果与讨论
2.1 对PC12细胞形态及存活率的影响

如图1所示, 在质量浓度为20.00 μ g/mL时, 3种溶液中PC12细胞形态上与阳性对照组无明显差异。PC12细胞在GEN溶液中存活率为(102.92± 6.68)%、DAI溶液中为(110.33± 8.67)%、GEN-DAI溶液中为(89.09± 0.62)%, 均与阳性对照组无显著差异。

图1 大豆异黄酮对PC12细胞形态的影响Fig.1 Effects of soy isoflavones on PC12 cells morphology

2.2 对PC12细胞抗氧化功能的影响

LDH主要存在于细胞内, LDH漏出率可以用来衡量细胞膜受损伤程度, LDH漏出率-1及LDH漏出率-2数值越大, 说明细胞膜受损伤程度越大, 通透性被改变。如表1所示, DAI和GEN-DAI溶液显著减少了LDH漏出率, 说明虽然它们对细胞存活率及细胞形态没有影响, 但是对细胞膜有显著的保护作用。MDA是细胞膜脂过氧化最重要的产物之一, 其含量可以反映机体内脂质的氧化水平即细胞受到氧化攻击的程度。GEN溶液对PC12细胞MDA含量有显著的增加作用, 可能是由于GEN单体具有强烈的还原活性, 与细胞膜中磷脂结合, 因而对细胞产生了一定的副作用。DAI和GEN-DAI溶液则与阳性对照组无显著差异。细胞的抗氧化防御系统包括抗氧化酶及非酶抗氧化物质两个部分, SOD是重要的抗氧化酶, 对防御细胞内过度的氧化应激与过量的活性氧(ROS)有重要作用。3种溶液对SOD活力及抑制率均无显著作用。GSH是细胞非酶抗氧化系统的重要成分, 3种溶液对GSH含量均有极显著的增加作用。RFI数值反应细胞ROS水平, GEN溶液显著提高了细胞ROS水平。暴露于20.00 μ g/mL的GEN溶液, 对细胞数量及细胞形态没有改变, 但可能由于其较强的还原活性, 造成细胞ROS水平升高, 细胞膜MDA含量增加; 为应对升高的ROS水平, GSH含量有所增加。暴露于20.00 μ g/mL的DAI溶液、GEN-DAI混合溶液, 对细胞数量及细胞形态没有改变, 但显著减小了LDH漏出率, 增强细胞膜活性, 同时提高细胞内GSH含量, 使细胞能更好应对氧化应激状态。

2.3 对PC12细胞培养液中ACh含量的影响

GEN、DAI两种溶液对PC12细胞培养液中ACh含量与阳性对照组无显著差异, 但GEN-DAI混合溶液却增加了PC12细胞培养液中ACh含量, 如图2所示。GEN-DAI混合物可以增加ChAT、ACh、AChE的表达, 其中AChE的表达增加, 理论上会降低ACh含量, 但由于同时增加了ChAT的表达, 综合作用增强了胆碱系统的代

表1 大豆异黄酮对PC12细胞抗氧化功能的影响 Table 1 Effects of soy isoflavonesisoflavones on antioxidant in PC12 cells

图2 大豆异黄酮对PC12细胞培养液中ACh的影响Fig.2 Effects of soy isoflavones on PC12 cells ACh content in culture medium

图3 大豆异黄酮对PC12细胞线粒体膜电位的影响Fig.3 Effects of soy isoflavones on PC12 cells mitochondrial membrane potential

谢, 从而提高ACh含量, 所以表现出ACh含量增加[11]。GEN-DAI混合溶液通过增加ACh含量来提高神经细胞活力, 有预防老年痴呆等功效[12]。

2.4 对PC12细胞线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位(见图3)是衡量细胞状态的重要指标, 可以表示细胞处于正常、损伤、凋亡、坏死等状态。通过荧光染色, 不同的细胞状态呈现不同的颜色。红色表示细胞状态良好; 黄色是红、绿两色的叠加颜色, 表示细胞膜电位发生下降, 细胞受到损伤, 但仍有活力; 绿色表示细胞已不能保持正常的膜电位, 细胞处于凋亡、坏死等状态。结合激光共聚焦照片(见图3(a)~(d)), PC12细胞均为红色, 表示3种溶液中的PC12神经细胞状态均良好, 线粒体膜电位没有显著影响。

3 结束语

质量浓度为20.00 μ g/mL的单一GEN、DAI溶液及GEN-DAI混合溶液对细胞存活率、细胞形态及线粒体膜电位没有影响, 但对PC12细胞有不同的作用。GEN溶液由于其较强的还原活性, 与细胞膜中磷脂结合, 造成了细胞ROS水平升高, 细胞膜MDA含量增加, 为应对升高的ROS水平, GSH含量有所增加。GEN溶液对PC12细胞培养液中ACh含量与阳性对照组无显著差异。DAI和GEN-DAI溶液对PC12细胞存活率与细胞形态上无显著影响, 都显著降低了LDH漏出率, 对细胞膜有保护作用; 同时增加细胞内GSH含量, 使细胞能更好应对氧化应激状态。DAI溶液对PC12细胞培养液中ACh含量与阳性对照组无显著差异, 但是GEN-DAI混合溶液增加培养液中ACh含量。原因是GEN-DAI混合溶液通过在一定范围内增加ACh的含量来提高神经细胞的活力, 增加了ChAT、ACh、AChE等基因的表达, 综合作用增强了胆碱系统的代谢, 从而提高了ACh的含量。

The authors have declared that no competing interests exist.

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