RNA解旋酶DHX37基因不同功能结构域载体的构建及鉴定

摘要/Abstract

摘要：

目的通过在线网站和软件预测人源RNA解旋酶DHX37基因的功能结构域，构建其不同功能结构域缺失载体，并验证构建载体的正确性。方法以人源DEAH-box解旋酶37（hDHX37）质粒作为模板，基于同源重组克隆技术，应用SnapGene V 6.0.2软件设计截短体ATP结合结构域（ΔATP binding）、C末端结构域（CTD）、HA2亚基（HA2）和Oligos/Accharide结合折叠域（O/A binding fold）的功能结构域特异性引物；采用高保真DNA聚合酶Prime STAR GXL polymerase进行PCR 扩增截短体目的片段ATP binding、c-terminal-1、c-terminal-2、HA2-1、HA2-2和O/A binding fold；利用重组克隆试剂盒将截短体片段定向克隆至经双酶切的 pCMV-MCS-3×HA-Neo空载体；将重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，通过限制性内切酶Hind Ⅲ酶切、琼脂糖核酸凝胶电泳和DNA测序验证功能结构域载体的正确性。结果 PCR 法扩增的目的片段ATP binding（2 148 bp）、c-terminal-1（1 326 bp）、c-terminal-2（1 269 bp）、HA2-1（2 205 bp）、HA2-2（894 bp）和O/A binding（2 583 bp）长度与设计一致；Hind Ⅲ单酶切突变质粒ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A binding fold，得到线性化DNA片段，长度分别为8 939、7 589、8 036、8 540和8 027 bp，产物条带大小均与设计相符。DNA测序Blast对比分析，ΔATP binding缺失ATP binding结构域（1~442）、Δc-terminal缺失c-terminal结构域（443~735）、ΔHA2缺失HA2结构域（736~861）和ΔO/A binding fold缺失O/A binding fold结构域（862~1 158），分别缺失1 326、879、375和891 bp，各突变质粒缺失的结构域位置和长度与设计完全一致。结论成功构建hDHX37基因的ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A binding fold 4个不同功能结构域载体。

关键词: DEAH-box解旋酶37, 功能结构域载体, 重组克隆, 限制性酶切, 聚合酶链式反应

Abstract:

Objective To discuss the functional domains of the human RNA helicase DHX37 gene predicted by online websites and software， to construct its different functional domain deletion vectors， and to verify the correctness of the constructed vectors 27. Methods Using the human DEAH-box helicase 37 （hDHX37） plasmid as a template， based on homologous recombination cloning technology， SnapGene V 6.0.2 software was used to design functional domain-specific primers for the truncations ATP binding domain （ATP binding）， C-terminal domain （CTD）， HA2 subunit （HA2）， and Oligos/Accharide binding fold domain （O/A binding fold）； prime STAR GXL polymerase， a high-fidelity DNA polymerase， was used to perform PCR amplification of the truncated target fragments ATP binding， c-terminal-1， c-terminal-2， HA2-1， HA2-2， and O/A binding； a recombination cloning kit was used to directionally clone the truncated fragments into the double-digested pCMV-MCS-3×HA-Neo empty vector； after transforming the recombinant vectors into E.coli DH5α competent cells， the correctness of the functional domain vectors was verified by restriction enzyme Hind Ⅲ digestion， agarose nucleic acid gel electrophoresis， and DNA sequencing. Results The lengths of the target fragments amplified by PCR， ATP binding （2 148 bp）， c-terminal-1 （1 326 bp）， c-terminal-2 （1 269 bp）， HA2-1 （2 205 bp）， HA2-2 （894 bp）， and O/A binding fold （2 583 bp）， were consistent with the design； Hind Ⅲ single enzyme digestion of the mutant plasmids ΔATP binding， Δc-terminal， ΔHA2， and ΔO/A binding fold yielded linearized DNA fragments with lengths of 8 939， 7 589， 8 036， 8 540， and 8 027 bp， respectively， and the product band sizes all matched the design. The DNA sequencing Blast comparative analysis results showed that ΔATP binding lacked the ATP binding domain （1-442）， Δc-terminal lacked the c-terminal domain （443-735）， ΔHA2 lacked the HA2 domain （736-861）， and ΔO/A binding fold lacked the O/A binding fold domain （862-1 158）， with deletions of 1 326， 879， 375， and 891 bp， respectively； the positions and lengths of the deleted domains in each mutant plasmid were completely consistent with the design. Conclusion The four different functional domain vectors of human DHX37 gene， ΔATP binding， Δc-terminal， ΔHA2， and ΔO/A binding fold， are successfully constructed.

Key words: DEAH-box helicase 37, Functional domain vector, Recombinan clone, Restriction enzyme digestion, Polymerase chain reaction

中图分类号:

R-331

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图/表 7

表1

图1

表2

图2

图3

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图5

参考文献 24

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Primer	Sequences of primers（5'-3'）
ATP F	CCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCACCATGTTCAACAAGCGGACACCGC
ATP R	AATCAGGTACGTCGTATGGGTACTCGAGGTGGACAGTGGT
c-terminal-1 F	CCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCACCATGGGGAAGCTG
c-terminal-1 R	CTCGGCGGCATGCACAGTCACTGGGAACTG
c-terminal-2 F	CTGTGCATGCCGCCGAGGAGC
c-terminal-2 R	AATCAGGTACGTCGTATGGGTACTCGAGGTGGACAGTGGT
HA2-1 F	CCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCACCATGGGGAAGCTG
HA2-1 R	TCCCACGGCAAGAAGGGCTTCCAC
HA2-2 F	GCCCTTCTTGCCGTGGGAGCCTGTG
HA2-2 R	AATCAGGTACGTCGTATGGGTACTCGAGGTGGACAGTGGT
O/A bind ATP F	CCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCACCATGGGGAAGCTG
O/A bind ATP R	AATCAGGTACGTCGTATGGGTACTCGAGGGCGCCCAGCAGC

Name of DNA	DNA concentration[ρ_B/（mg·L^-1）]	Volume added （V/μL）
ATP binding	229.6	1.0
O/A binding	199.3	1.0
c-terminal-1	120.0	0.4
c-terminal-2	214.1	0.2
HA2-1	158.4	0.4
HA2-2	220.3	0.2