%A 陈晓娜, 王晓丹, 孙丽光, 方芳, 崔巍巍, 杨永广, 刘娅 %T 携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定 %0 Journal Article %D 2017 %J 吉林大学学报(医学版) %R 10.13481/j.1671-587x.20170201 %P 213-219 %V 43 %N 02 %U {http://xuebao.jlu.edu.cn/yxb/CN/abstract/article_3879.shtml} %8 2017-03-28 %X 目的:构建真核表达质粒hTERT-P2A-EGFP,探讨其在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。方法:利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP质粒构建重组质粒。以该质粒为模板采用PCR法获取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP,经酶切后目的片段与真核表达载体pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP连接,得到并鉴定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重组质粒。经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达。结果:PCR检测目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段长度分别为3400、110和720 bp。酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP约4300 bp。测序分析,目的基因1547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与 GenBank 公布的基因序列完全一致。重组质粒转染HEK293FT细胞后在荧光显微镜下可以观察到GFP。流式细胞术检测,重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。结论:成功构建携带目的基因hTERT-P2A-EGFP的重组质粒,且可用于细胞转染。