Notch1信号通路对肺腺癌细胞侵袭和顺铂耐药的影响及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20210513

摘要/Abstract

摘要： 目的

观察阻断Notch1信号通路对肺腺癌细胞侵袭、血管生成和上皮-间质转化（EMT）及其对顺铂敏感性的影响，阐明Notch1信号通路在肺腺癌侵袭和转移及顺铂耐药中的作用及相关机制。

方法

以γ-分泌酶抑制剂（DAPT）作为Notch1信号通路阻断剂作用A549细胞，分为0 μmol·L^－1 DAPT组（对照组）、10 μmol·L^－1DAPT组和20 μmol·L^－1DAPT组。采用Transwell 小室实验检测各组A549细胞中侵袭细胞数，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组细胞培养上清液中基质金属蛋白酶9 （MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）水平，Western blotting法检测各组A549细胞中Notch1、Hes1、波形蛋白（Vimentin）、N钙黏附蛋白（N-cadherin）和Ｅ钙黏附蛋白（E-cadherin）蛋白表达水平，CCK-8法检测顺铂（0.625~5.000 mg·L^－1）作用各组A549细胞的生长抑制率，Western blotting法检测0 和1.250 mg·L^－1顺铂单独作用A549细胞后Notch1和Hes1蛋白表达水平以及其单独和联合10 μmol·L^－1 DAPT作用A549细胞后P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）蛋白表达水平。

结果

与对照组比较，10和20 μmol·L^－1 DAPT组A549细胞中侵袭细胞数明显减少（P<0.05 或 P<0.01），细胞培养上清液中MMP-9和VEGF水平明显降低（P<0.05 或 P<0.01），A549细胞中Notch1、Hes1、Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.05 或 P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与对照组比较，10和20 μmol·L^－1 DAPT组A549细胞的生长抑制率明显升高（P<0.05 或 P<0.01）。与0 mg·L^－1顺铂组比较，1.250 mg·L^－1顺铂组A549细胞中Notch1、Hes1、P-gp和MRP1蛋白表达水平明显升高（P<0.05 或 P<0.01）；与1.250 mg·L^－1顺铂组比较，1.250 mg·L^－1顺铂联合10 μmol·L^－1 DAPT组A549细胞中P-gp和MRP1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。

结论

阻断Notch1信号通路可抑制肺腺癌细胞的侵袭并降低其对顺铂的耐药作用。

关键词: 肺肿瘤, Notch1, 细胞侵袭, 细胞转移, 顺铂, 多药耐药

Abstract:

Objective： To observe the effects of blocking Notch1 signaling pathway on the cell invasion， angiogenesis， epithelial mesenchymal transition （EMT），and chemosensitivity to cisplatin of the lung adenocarcinoma cells， and to elucidate the role and related mechanism of Notch1 signaling pathway in the cell invasion， metastasis and cisplatin resistance of lung adenocarcinoma.

Methods

The A549 cells were treated with DAPT （N-［N-（3，5-Difluorophenacetyl）-l-alanyl］-S-phenylglycine t-butyl ester） as an inhibitor of Notch1 signaling pathway and divided into 0 μmol·L^－1 DAPT group（control group），10 μmol·L^－1 DAPT group and 20 μmol·L^－1 DAPT group. Transwell chamber assay was used to detect the number of invasion cells of A549 cells in various groups； ELISA assay was used to detect the levels of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in the supernatant of cells in various groups； Western blotting method was performed to detect the expression levels of Notch1， Hes1， Vimentin， N-cadherin and E-cadherin proteins in the cells in various groups； CCK-8 method was used to detect the inhibitory rates of growth of the A549 cells after treated with cisplatin （0.625－5.000 mg·L^－1） in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of Notch1 and Hes1 proteins in the A549 cells after treated with 0 and 1.250 mg·L^－1cisplatin alone， and the expression levels of P-glycoprotein （P-gp） and multidrug resistance-associated protein 1 （MRP1） proteins in the A549 cells after treated with 1.250 mg·L^－1cisplatin alone or combination with 10 μmol·L^－1 DAPT.

Results

Compared with control group， the number of invasion cells in 10 and 20 μmol·L^－1 DAPT groups was significantly decreased （P<0.05 or P<0.01），the levels of MMP-9 and VEGF in in the cell supernatant were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， the expression levels of Notch1， Hes1， Vimentin and N-cadherin proteins in the A549 cells were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01），and the expression levels of E-cadherin protein were significantly increased （P<0.05）.Compared with control group， the inhibitory rates of growth of the A549 cells in 10 and 20 μmol·L^－1 DAPT groups were significantly increased after treated with different concentrations of cisplatin （P<0.05 or P<0.01）.Compared with 0 mg·L^－1cisplatin group， the expression levels of Notch1， Hes1， P-gp and MRP1 proteins in the A549 cells in 1.250 mg·L^－1cisplatin group were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with 1.250 mg·L^－1cisplatin group， the expression levels of P-gp and MRP1 proteins in the A549 cells in 1.250 mg·L^－1cisplatin combined with 10 μmol·L^－1 DAPT group were significantly decreased （P<0.01）.

Conclusion

Blocking Notch1 signaling pathway may inhibit the cell invasion and reduce the cisplatin resistance in the lung adenocarcinoma cells.

Key words: lung neoplasm, Notch1, cell invasion, cell metastasis, cisplatin, multidrug resistance

中图分类号:

R734.2

陈立松,房惠,王鹤霏,何程远,盖晓东,历春. Notch1信号通路对肺腺癌细胞侵袭和顺铂耐药的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(5): 1171-1177.

Lisong CHEN,Hui FANG,Hefei WANG,Chengyuan HE,Xiaodong GAI,Chun LI. Effects of Notch1 signaling pathway on invasion and cisplatin resistance of lung adenocarcinoma cells and their mechanisms[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2021, 47(5): 1171-1177.

图/表 8

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表１

图2

表2

表3

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表4

参考文献 24

1	CHEN W， ZHENG R， ZHANG S， et al. Cancer incidence and mortality in China， 2013 ［J］. Cancer Lett， 2017， 401： 63-71.
2	HERRICK D B， LIN B， PETERSON J， et al. Notch1 maintains dormancy of olfactory horizontal basal cells， a reserve neural stem cell ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2017， 114 （28）： E5589-E5598.
3	TEOH S L， DAS S. Notch signalling pathways and their importance in the treatment of cancers ［J］. Curr Drug Targets， 2018， 19 （2）： 128-143.
4	QIAN X Q， TANG S S， SHEN Y M， et al. Notch1 affects chemo-resistance through regulating epithelial-mesenchymal transition （EMT） in epithelial ovarian cancer cells ［J］. Int J Med Sci， 2020，17（9）：1215-1223.
5	PU Z， YANG F， WANG L， et al. Advancements of compounds targeting Wnt and Notch signalling pathways in the treatment of inflammatory bowel disease and colon cancer ［J］. J Drug Target， 2020， 28： 1-13.
6	FAHIM Y， YOUSEFI M， IZADPANDAH M H，et al. TWIST1 correlates with Notch signaling pathway to develop esophageal squamous cell carcinoma ［J］. Mol Cell Biochem， 2020， 474 （1/2）： 181-188.
7	WEIJZEN S， RIZZO P， BRAID M， et al. Activation of Notch-1 signaling maintains the neoplastic phenotype in human Ras-transformed cells ［J］．Nat Med，2002，8（9）：979-986．
8	YANG Y L， JABLONS D， YOU L. An alternative way to initiate Notch1 signaling in non- small cell lung cancer［J］.Transl Lung Cancer Res，2014，3（4）： 238-241.
9	ZOU B， ZHOU X L， LAI S Q， et al. Notch signaling and non-small cell lung cancer ［J］. Oncol Lett， 2018， 15 （3）： 3415-3421.
10	YUAN X， WU H， XU H， et al. Meta-analysis reveals the correlation of Notch signaling with non-small cell lung cancer progression and prognosis ［J］. Sci Rep， 2015， 5： 10338.
11	ELIASZ S， LIANG S， CHEN Y， et al. Notch-1 stimulates survival of lung adenocarcinoma cells during hypoxia by activating the IGF-1R pathway ［J］. Oncogene， 2010， 29 （17）： 2488-2498.
12	HUANG S， LI C， HUANG J， et al. LncRNA FEZF1-AS1 promotes non-small lung cancer cell migration and invasion through the up-regulation of NOTCH1 by serving as a sponge of miR-34a ［J］. BMC Pulm Med， 2020， 20 （1）： 110.
13	TANG Y Q， JAGANATH I B， MANIAM R， et al. Phyllanthus spp. exerts anti-angiogenic and anti-metastatic effects through inhibition on matrix metalloproteinase enzymes ［J］. Nutr Cancer， 2015， 67 （5）：783-795.
14	PITTAYAPRUEK P， MEEPHANSAN J， PRAPAPAN O， et al. Role of matrix metalloproteinases in photoaging and photocarcinogenesis ［J］. Int J Mol Sci， 2016， 17 （6）： 868.
15	HAFEEZ B BIN， ADHAMI V M， ASIM M， et al. Targeted knockdown of Notch1 inhibits invasion of human prostate cancer cells concomitant with inhibition of matrix metalloproteinase-9 and urokinase plasminogen activator ［J］. Clin Cancer Res， 2009， 15 （2）： 452-459.
16	SADREMOMTAZ A， KOBARFARD F， MANSOURI K，et al.Suppression of migratory and metastatic pathways via blocking VEGFR1 and VEGFR2［J］.J Recept Signal Transduct Res， 2018， 38 （5/6）： 432-441.
17	ZANG M， HU L， ZHANG B， et al. Luteolin suppresses angiogenesis and vasculogenic mimicry formation through inhibiting Notch1-VEGF signaling in gastric cancer ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2017， 490 （3）： 913-919.
18	TSUBAKIHARA Y， MOUSTAKAS A. Epithelial-mesenchymal transition and metastasis under the control of transforming growth factor β ［J］. Int J Mol Sci，2018， 19 （11）： 3672.
19	SHAO S， ZHAO X， ZHANG X， et al. Notch1 signaling regulates the epithelial-mesenchymal transition and invasion of breast cancer in a Slug-dependent manner ［J］. Mol Cancer， 2015， 14 （1）： 28.
20	VINSON K E， GEORGE D C， FENDER A W， et al. The Notch pathway in colorectal cancer ［J］. Int J Cancer， 2016， 138 （8）：1835-1842.
21	程少燕，李峰，平玉，等.抑制Notch1信号通路对CD8⁺ T细胞免疫检查点、功能及增殖的影响［J］.郑州大学学报（医学版），2019，54（3）：323-326.
22	TSANG R Y， Al-FAYEA T， AU H J. Cisplatin overdose： toxicities and management ［J］. Drug Saf， 2009， 32 （12）： 1109-1122.
23	WANG M， MA X， WANG J， et al. Pretreatment with the γ-secretase inhibit or DAPT sensitizes drug-resistant ovarian cancer cells to cisplatin by downregulation of Notch signaling ［J］.Int J Oncol， 2014，44（4）：1401-1409.
24	ZENG D， LIANG Y K， XIAO Y S， et al. Inhibition of Notch1 reverses EMT and chemoresistance to cisplatin via direct downregulation of MCAM in triple-negative breast cancer cells ［J］. Int J Cancer， 2020，147（2）： 490-504.

Group	MMP-9	VEGF
Control	438.00±23.07	351.90±18.49
10 μmol·L^－1 DAPT	379.17±20.28 ^*	302.83±16.50 ^*
20 μmol·L^－1 DAPT	313.57±17.49 ^**	284.17±14.27 ^**
F	27.919	13.467
P	< 0.01	< 0.01

Group	Notch1	Hes1	Vimentin	N-cadherin	E-cadherin
Control	1.17±0.15	1.01±0.10	0.74±0.11	0.68±0.09	0.56±0.06
10 μmol·L^－1 DAPT	0.77±0.08^*	0.74±0.06^*	0.38±0.07^**	0.48±0.06^**	0.64±0.08
20 μmol·L^－1 DAPT	0.51±0.06^**	0.53±0.06^**	0.30±0.05^**	0.29±0.04^**	0.81±0.11^*
F	28.288	31.269	25.774	35.10	8.808
P	<0.01	<0.05	<0.01	<0.01	<0.05

Group	Inhibitory rate of growth
Group	(mg·L^－1)	0.625	1.250	2.500	5.000
DDP		7.51±0.66	14.30±2.04	24.90±2.72	47.50±2.50
DDP+10 μmol·L^－1 DAPT		9.37±1.12^*	22.30±2.70^*	32.90±2.20^*	53.90±2.10^*
DDP+20 μmol·L^－1 DAPT		12.90±1.90^**	25.60±1.29^**	36.70±2.07^**	55.30±2.52^**
F		12.974	23.253	19.943	9.105
P		<0.01	<0.01	<0.01	<0.05

Group	P-gp	MRP1
0 mg·L^－1 DDP	0.29±0.04	0.35±0.06
1.250 mg·L^－1 DDP	0.57±0.06^*	0.65±0.07^*
1.250 mg·L^－1 DDP+ 10 μmol·L^－1 DAPT	0.35±0.05^△	0.41±0.05^△
F	25.807	22.217
P	< 0.01	< 0.01

[1]	周肖,代海涛,丁云杉,张林杰,仵楠. 基于葡萄籽原花青素对口腔鳞状细胞癌抗癌作用的网络药理学分析和体外实验验证[J]. 吉林大学学报(医学版), 2026, 52(3): 651-662.
[2]	翟丽,陈孟,罗建波,张爱利,王良晓,魏颖,张曦. miR-214-3p与EZH2的靶向关系及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭和凋亡的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2026, 52(2): 460-468.
[3]	李红,于盼盼,赵邹宇,孙崇凤,乔慧,杨萍. GSTO1在卵巢癌组织中的表达及其N-糖基化位点突变对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2026, 52(2): 469-482.
[4]	丁云杉,代海涛,陈敏,郝小慧,周肖,仵楠. 沉默TRPV2基因和大麻二酚对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞生物学行为的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2026, 52(1): 143-151.
[5]	朱平胜,葛思堂,左芦根,陈德利,张洋洋. miR-325-3p靶向PRELID1基因介导EMT通路对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(5): 1185-1193.
[6]	闫荣免,孙新婷,关欣,程谕,韩丽英. KLK5过表达对裸鼠皮下移植瘤生长及顺铂敏感性的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(5): 1194-1203.
[7]	沈忠军,赵钥,贾茗博,赵丽艳. 缺氧诱导因子在胶质瘤细胞上皮-间质转化过程中对细胞迁移和侵袭影响的研究进展[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(4): 1145-1154.
[8]	何小双,徐丽娜,崔梅,赵宇,王蓓,黄征,王玉超,辛雯艳,邬超. 肺癌A549细胞源性外泌体中lncRNA DUXAP8对肺癌细胞生长和肿瘤免疫逃逸的作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(4): 958-967.
[9]	李宏丽,王梦瑶,刘洋洋,张卉,李丽. KHSRP通过激活JAK/STAT信号通路对结直肠癌细胞生物学行为的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(4): 996-1006.
[10]	王星翔,赵颖,任俏同,王鹤霏,蒲刚,历春. M2巨噬细胞通过调控NF-κB信号通路对非小细胞肺癌A549细胞上皮-间质转化和顺铂耐药的促进作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(3): 642-652.
[11]	王繁,温馨,王艺璇,王远. 缝隙连接蛋白β2对肺腺癌患者预后及肺腺癌A549细胞生物学行为的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(3): 716-726.
[12]	王艺慧,张晴,李英楠,叶丽平. KIAA1522对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(3): 727-739.
[13]	牛凯琦,昌贺,律广富,郑彭予,迟雪婷,周佳,王雨辰,黄晓巍. 黄芪甲苷对顺铂所致小鼠肝损伤的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(2): 370-377.
[14]	武鹏立,李凤玉,刘博,吕洋. 沉默DDX39A基因对食管癌TE-1细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(1): 115-123.
[15]	杨露,傅家财,李凤金,齐玲. 五味子乙素对胰腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(1): 44-50.