吉林大学学报(医学版) 2014, 40(03) 529-533 DOI: 10.13481/j.1671-587x.20140313    ISSN: 1671-587X CN: 22-1342/R
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基础研究
rhKD/APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化
王心童1，王虹蛟2，王强2，孟威宏3，颜炜群4，任立群4
1．吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林 长春130033；2．解放军第461医院内科，吉林 长春130021；3．沈阳军区总医院心血管内科，辽宁 沈阳110015；4．吉林大学再生医学科学研究所再生医学系，吉林 长春130021
摘要：

目的：构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体（rhKD/APPvar）的毕氏酵母工程菌，建立适合大规模发酵、纯化rhKD/APPvar的工艺。方法：利用已构建的rhKD/APP表达质粒，在其活性中心两侧设计2个酶切位点（ApaⅠ和SacⅡ），实现人KD/APP活性中心RAM与BPTI活性中心KAR的替换,构建rhKD/APPvar表达质粒。将重组质粒转化到酵母菌X-33中，优化rhKD/APPvar表达最佳pH值，使rhKD/APPvar获得高效表达。利用阳离子交换树脂和超滤除盐对重组蛋白进行纯化。结果：酶切鉴定和测序分析显示成功构建了KD/APPvar-pPICZαC重组质粒。经电转化成功地将重组质粒转化至酵母菌X-33中。SDS-PAGE分析，甲醇诱导表达后在相对分子质量约6 700处出现蛋白条带，pH 6.0、甲醇诱导 120 h蛋白表达水平最高，经纯化获得纯度达95%的重组蛋白。结论：成功构建KD/APPvar- pPICZαC重组质粒，经毕赤酵母表达和纯化获得了rhKD/APPvar蛋白。
关键词： 毕赤酵母菌 重组KD／APP变异体 牛胰蛋白酶抑制剂 淀粉样蛋白前体
收稿日期  2013-10-17   修回日期    网络版发布日期  2014-06-05  
DOI: 10.13481/j.1671-587x.20140313
基金项目:

国家自然科学基金资助课题（30300153）
通讯作者: 孟威宏（Tel：024-28856101,E-mail:wqwhj461@163.com）
作者简介: 王心童（1989-），女，吉林省长春市人，在读医学硕士，主要从事再生医学和神经病学研究。
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