吉林大学学报(医学版) 2020, 46(03) 444-450 DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200303    ISSN: 1671-587X CN: 22-1342/R
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	基础研究
	RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立
	陈少凤1, 李胜男2, 邓福2, 朱佩仪2, 李友1
	1. 广东省衰老相关心脑疾病重点实验室, 广东 湛江 524002; 2. 广东医科大学附属医院神经病学研究所, 广东 湛江 524002
	摘要：目的：构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体，建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞，为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列，设计并合成引物，PCR扩增RHBDF2基因后通过Gateway克隆技术将目的基因克隆至入门载体，再亚克隆至慢病毒载体pLV[Exp]-EGFP，构建重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2；将慢病毒表达载体质粒pLV[Exp]-EGFP和重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2分别与慢病毒辅助包装质粒共转染HEK293T细胞，包装慢病毒并测定慢病毒滴度；将感染pLV[Exp]-EGFP-control的EA.hy926细胞作为对照组，感染pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2的EA.hy926细胞作为实验组，利用嘌呤霉素筛选出稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞；荧光定量PCR （qPCR）和Western blotting法检测对照组和实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切电泳和测序检测，实验组过表达慢病毒载体的基因序列与设计合成的序列完全一致；对照组包装的慢病毒滴度为1×108 TU·mL-1，实验组慢病毒的滴度为3×108 TU·mL-1；荧光显微镜下慢病毒成功感染EA.hy926细胞，感染率达95%以上；qPCR检测，实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA表达水平较对照组明显升高（P<0.01）；Western blotting法检测，实验组EA.hy926细胞中RHBDF2蛋白表达水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论：成功构建RHBDF2过表达慢病毒载体，利用pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒建立了稳定上调RHBDF2表达的EA.hy926细胞系。
	关键词： RHBDF2 慢病毒载体 HEK293T细胞 EA.hy926细胞
	收稿日期  2019-07-09   修回日期    网络版发布日期  2020-06-11
	DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200303
	基金项目: 国家自然科学基金资助课题（81571157）
	通讯作者: 李友,副研究员,硕士研究生导师(Tel:0759-2386772,E-mail:youli805@163.com)
	作者简介: 陈少凤(1992-),女,广西壮族自治区玉林市人,在读医学硕士,主要从事脑血管疾病发病机制方面的研究。
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