关新刚1,苏维恒2,于欣3,佟海滨1,孙新1
GUAN Xin-gang1,SU Wei-heng2,YU Xin3,TONG Hai-bin1,SUN Xin1
摘要:
目的:获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白(GFP)标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法:应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度(0.5和1.0 mmol•L-1)和不同温度(22℃和37℃)诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。 结果:0.5和1.0 mmol•L-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温(22℃)诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。 结论:低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。
中图分类号: