吉林大学学报(医学版) 2019, 45(04) 766-771 DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190404    ISSN: 1671-587X CN: 22-1342/R
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	基础研究
	含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定
	梁春梅1, 许旭三1, 余华军2, 周霞1, 温霞1, 李友1, KOJIC Snezana3, 汪亚君4, 马国达1,5
	1. 广东医科大学附属医院广东省衰老相关心脑疾病重点实验室, 广东 湛江 524001; 2. 广东医科大学实验动物中心, 广东 湛江 524023; 3. 塞尔维亚贝尔格莱德大学分子遗传学及遗传工程研究所, 塞尔维亚 贝尔格莱德 11010; 4. 广东医科大学附属医院临床医学研究中心, 广东 湛江 524001; 5. 黑龙江八一农垦大学生命科学与技术学院, 黑龙江 大庆 163319
	摘要：目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒，为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体，行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T，进行病毒包装和扩增，采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞，荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞，分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组，Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序，CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后，在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后，与对照组比较，CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01），shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒，后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。
	关键词： 心脏阿霉素反应蛋白 RNA干扰 慢病毒 H9C2细胞
	收稿日期  2018-09-25   修回日期    网络版发布日期  2019-08-02
	DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190404
	基金项目: 国家自然科学基金资助课题（81670252，81770034，81571157）；黑龙江省教育厅基金资助课题（12521379）；广东省科技厅自然科学基金资助课题（2015A030313523）；中国-塞尔维亚科技合作委员会第3届例会项目资助课题（3-13）；2016年度中共广东省委组织部与广东省人力资源与社会保障厅"扬帆计划"培养高层次人才项目资助课题（4YF17006G）
	通讯作者: 马国达,副教授,硕士研究生导师(Tel:0759-2386949,E-mail:sihan1107@126.com)
	作者简介: 梁春梅(1990-),女,广东省湛江市人,实习研究员,医学硕士,主要从事心脑血管疾病基础和临床方面的研究。
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