吉林大学学报(医学版) 2019, 45(06) 1224-1230 DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190606    ISSN: 1671-587X CN: 22-1342/R
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基础研究
RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立
李胜男1, 陈吴海2, 陈少凤3, 邓福3, 朱佩仪3, 李友1
1. 广东省衰老相关心脑疾病重点实验室, 广东 湛江 524001;
2. 中国热带农业科学院农产品加工研究所, 广东 湛江 524001;
3. 广东医科大学附属医院神经病学研究所, 广东 湛江 524001
摘要：目的：构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体，建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系，并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列，设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo，退火后将其连接到经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中，构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒，通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料，FV067 Vector作为对照组，FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK293T细胞中，转染48 h收集并纯化慢病毒，分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数（MOI）为50时感染Neuro-2a细胞，荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达，采用2 mg·L-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平，免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果：PCR和测序，RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×108 TU·mL-1，FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×108 TU·mL-1。实时荧光定量PCR检测，实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%（t=11.44，P=0.0076）。免疫印迹法检测，与对照组比较，实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%（t=6.374，P=0.0078）。结论：成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系，且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2mRNA和蛋白表达水平明显降低。
关键词： RHBDF2 RNA干扰 慢病毒 HEK 293T细胞Neuro-2a细胞 稳转细胞系
收稿日期  2019-03-29   修回日期    网络版发布日期  2019-12-05  
DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190606
基金项目: 国家自然科学基金资助课题（81571157）
通讯作者: 李友,副研究员,硕士研究生导师(Tel:0759-2386772,E-mail:youli805@163.com)
作者简介: 李胜男(1992-),女,安徽省淮北市人,研究实习员,理学硕士,主要从事神经退行性疾病发病机制方面的研究。
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