建立一种规模化的牛奶外泌体纯化工艺，用于实验室制备和工业规模生产，并评价牛奶外泌体的分子与细胞生物学活性。

取市售多种全脂或脱脂牛奶，以外泌体提取金标准——超速离心法（UC）作为对照，采用多种化学前处理方法去除乳蛋白，切向流超滤技术（TFF）进一步去除残留的乳蛋白，并实现牛奶样品的初纯与浓缩，多模式色谱法（BE-SEC）精纯牛奶外泌体，采用纳米流式细胞术（NanoFCM）检测牛奶外泌体的粒径、颗粒浓度和纯度，透射电子显微镜（TEM）观察牛奶外泌体的形态表现，高效液相色谱（HPLC）验证牛奶外泌体的尺寸和纯度， Western blotting 法检测牛奶外泌体特异性蛋白的表达，基因本体（GO）富集分析差异表达微小RNA（miRNA）的候选靶基因， DAVID Bioinformatics Resources 6.8和KOBAS软件检测京都基因和基因组百科（KEGG）通路中目标候选基因的统计富集度，CytoFlex流式细胞术检测细胞对牛奶外泌体的摄取情况，流式细胞术检测牛奶外泌体作用后Caco-2细胞凋亡率。

工艺研究，磷酸钠沉淀法在操作便利性、方法稳定性和产品质量方便均优于其他预处理方法。TFF法可进一步去除残留乳蛋白并可实现液体浓缩目的，有效衔接至下游BE-SEC精纯方法。以该三步工艺所得外泌体样品经TEM成像显示均呈典型的盘状或杯状外泌体形态。NanoFCM法检测的样品粒径为30~150 nm，且优于UC所得外泌体样本纯度。Western blotting 法检测，确定外泌体样品含有CD81、Alix和TSG101等外泌体特异性标志物。SEC-HPLC分析，不同批次终产物均为单一均质峰，无游离蛋白污染。GO与和KEGG数据库分析，牛奶外泌体富含免疫相关蛋白与炎症反应调节信号通路相关miRNA。上述制备工艺所得外泌体具备高效穿透细胞膜的能力，4 h内入胞比例达99%。

建立了一套由化学沉淀前处理、TFF和BE-SEC三步结合的牛奶外泌体高纯度制备工艺方法。该工艺方法所得牛奶外泌体纯度、产率均优于金标准——UC所得样品。样品理化性质符合典型牛奶外泌体标准，可在数小时内穿透细胞膜，并富含免疫与炎症反应调控相关miRNA。