WNT4基因沉默对PAX2诱导肾小管上皮细胞间充质转分化的影响
李里1,2，南晓娟1，吴玉斌1
- 1.中国医科大学附属盛京医院小儿肾脏风湿免疫科，辽宁 沈阳 110004；2.辽宁医学院附属第一医院儿科，辽宁 锦州 121000
Influence of WNT4 siRNA in PAX2-induced epithelial-mesenchymal transition in normal renal tubular epithelial cells
LI Li1,2，NAN Xiao-juan1，WU Yu-bin1
- 1. Department of Pediatric Nephrology and Rheumatology,Shengjing Hospital,China Medical University,Shenyang 110004,China；2. Department of Pediatrics,First Affiliated Hospital, Liaoning Medical College,Jinzhou 121000,China
摘要：
目的：观察体外转染配对盒基因2（PAX2）对WNT4通路的激活作用及WNT4通路对PAX2诱导转分化的作用，探讨PAX2转分化机制。方法：应用脂质体介导将重组质粒pEGFP-PAX2转染入体外培养的大鼠肾小管上皮细胞，经G418 筛选，建立稳定表达PAX2细胞系。细胞分为稳定转染PAX2组、空载组和对照组。Western blotting法和实时荧光定量(Real-time)PCR法检测各组细胞WNT4和β-catenin表达。应用靶向WNT4基因的siRNA沉默稳定转染PAX2细胞的WNT4，应用荧光显微镜观察转染效率，进行沉默鉴定筛选出最佳干扰链。将最佳干扰链WNT4 siRNA转染至稳定转染PAX2细胞。在沉默24、48、72和96 h应用Western blotting法和Real-time PCR法检测β-catenin、正常肾小管上皮细胞表型标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和成纤维细胞表型标志物α-肌动蛋白（α-SMA）表达，同时筛选出沉默最佳时间点。应用免疫组织化学染色法检测沉默最佳时间点组E-cadherin和α-SMA蛋白表达。结果：Western blotting和Real-time PCR检测，稳定转染PAX2细胞组WNT4 和β-catenin蛋白及mRNA表达水平较空载组和对照组明显增加（P<0.05）。阴性siRNA转染入稳定转染PAX2细胞24 h 后荧光显微镜观察，转染效率为47.46％±4.48％。3条WNT4干扰链分别转染至稳定转染PAX2细胞，Real-time PCR和Western blotting结果显示第3干扰链沉默效果最佳，WNT4 mRNA 表达抑制率为66.9 ％±3.8％（P<0.05）； WNT4 蛋白表达抑制率为63.7％±2.5％（P<0.05）。将最佳干扰链转染至稳定转染PAX2细胞，干扰24、48、72和96 h后，各时间点细胞中的β-catenin mRNA及蛋白表达水平较对照组下调，72 h组下调明显（P<0.05）；各时间点细胞中E-cadherin mRNA及蛋白表达水平较对照组明显上调，72 h组上调明显（P<0.05）；各时间点细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平较对照组明显下调，72 h下调明显（P<0.05）。结论：PAX2转染至肾小管上皮细胞后激活了WNT4通路，PAX2在体外诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化可能是通过WNT4/β-catenin通路完成。
中图分类号:
- R586
