建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备
李 松1，杨立彬2，张舒岩3，金 羽1，陈秀华1，李 新1，刘 玲1，李树蕾4,李树红1
- （1. 四川农业大学食品学院水产品加工理论与技术实验室，四川 雅安 625000；2. 吉林大学第一医院儿科，吉林 长春 130021；3.吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021;4.吉林大学基础医学院组织学与胚胎学系，吉林 长春 130021）
Prokaryotic expression and identification of recombinant Cystatin of Cyprinus carpio var.Jian and preparation of its polyclonal antibody
LI Song1,YANG Li-bin2,ZHANG Shu-yan3,JIN Yu1,CHEN Xiu-hua 1,LI Xin1,LIU Ling1,LI Shu-lei4,LI Shu-hong1
- (1. Department of Theory and Technology of Fishery Product Processing,Food Institute,Sichuan Agriculture University,Ya’an 625000,China;2. Department of Pediatrics,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China;3. Department of Neurosurgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China;4.Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China)
摘要：
目的：对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs)Cystatin进行原核表达和纯化鉴定，并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体。方法：用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET-30a-Cystatin的E.coli BL21（DE3）表达重组蛋白，经过Ni2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin，高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度，Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用。利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清，采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价，Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性。结果：原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000；镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带，纯度>95%；Azocasein法检测，0.014 μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50%以上；ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1∶512 000；Western blotting检测，转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在，而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号，且均为单一条带；免疫组织化学检测，建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色，抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合。结论：成功表达和纯化了建鲤Cystatin；获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清，具有高特异性和灵敏性。
中图分类号:
