基于CRISPR/Cas9技术敲除PD-L1对非小细胞肺癌 PC-9/T790M细胞吉非替尼耐药敏感性的影响

doi:10.13481/j.1671-587X.20210206

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨在具有T790M突变的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除程序性细胞死亡配体1（PD-L1）后对吉非替尼耐药敏感性的影响，阐明PD-L1对PC-9/T790M细胞耐药敏感性的作用机制。

方法

常规体外培养PC-9细胞和 PC-9/T790M细胞，经CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PC-9/T790M细胞中PD-L1后，分为PC-9、PC-9/T790M和Cas9 PC-9/sgRNA 3组细胞。采用Western blotting 法检测各组细胞中PD-L1蛋白表达水平，CCK-8法检测5、10和20 mmol·L^－1吉非替尼干预24、48和72 h后各组细胞存活率。体内实验中检测吉非替尼干预后各组移植瘤体积，HE染色观察移植瘤组织病理形态表现。

结果

Western blotting 法检测，经CRISPR/Cas9编辑后敲除PD-L1的sgRNAl#组与PC-9、PC-9/T790M、sgRNA2#和sgRNA3#组比较，PD-L1蛋白表达水平最低。CCK-8法检测，在应用药物干预前Cas9 PC-9/sgRNA组细胞增殖活性与PC-9组、PC-9/T790M组比较，差异无统计学意义（P>0.05），10 mmol·L^－1吉非替尼干预72 h后PC-9组和Cas9 PC-9/sgRNA1#组细胞存活率与PC-9/T790M组比较明显降低（P<0.01）。体内实验，与PC-9/T790M组比较，吉非替尼干预后PC-9组和Cas9 PC-9/sgRNA1#组裸鼠移植瘤体积明显减少（P<0.05）；PC-9组和Cas9 PC-9/sgRNA1#组移植瘤细胞呈现中、重度坏死，而PC-9/T790M组移植瘤组织病理形态无明显变化。

结论

在耐药PC-9/T790M细胞中应用CRISPR/Cas9编辑技术敲除PD-L1能够明显提高吉非替尼的药物敏感性。

关键词: CRISPR/Cas9基因编辑技术, T790M细胞, 程序性细胞死亡配体1, 吉非替尼, 耐药敏感性

Abstract: Objective

To investigate the effect of CRISPR/Cas9 gene-editing knockout of programmed cell death ligand 1（PD-L1） on the geffitinib resistance sensitivity in the non-small cell lung cancer （NSCLC） cells with T790M mutation， and to clarify the mechanism of the effect of PD-L1 on the drug resistance sensitivity of PC-9/T790M cells.

Methods

The PC-9 cells and PC-9/T790M cells were cultured in vitro. After CRISPR/ Cas9 gene editing technology was used to knock out PD-L1 in the PC-9/T790M cells， the cells were divided into three groups： PC-9 group， PC-9/T790M group and Cas9 PC-9/sgRNA group.The expression levels of PD-L1 protein in the cells in various groups were detected by Western blotting method， and CCK-8 method was used to determine the survival rates of the cells in various groups after 24，48 and 72 h of intervention with 5，10 and 20 mmol·L^－1gefitinib. In vivo experiments，the tumor volumes in vorious groups were detected after gefitinib intervention， and the pathomorphology of transplanted tumor tissue in various groups was observed.

Results

The Western blotting results showed that the expression level of PD-L1 protein in sgRNA1# group edited by CRISPR/ Cas9 was the lowest compared with PC-9， PC-9/T790M， sgRNA2# and sgRNA3# groups. There were no statistically significant differences in the cell proliferation activities in Cas9 PC-9 /sgRNA group compared with other two groups before drug intervention detected by CCK-8 method （P>0.05）. After 10 mmol·L^－1 gefitinib intervention for 72 h， the survival rates of cells in PC-9 and Cas9 PC-9/sgRNA1# groups were significantly lower than that in PC-9/T790M group （P<0.01）.In vivo experiment， compared with PC-9/T790M group， the tumor volumes in PC-9 group and Cas9 PC-9/sgRNA1# group were significantly reduced after gefeitinib intervention （P<0.05）；moderate to severe cell necrosis was found in PC-9 group and Cas9 PC-9/sgRNA1 group， while no significant changes in transplanted tumor tissue were found in PC-9/T790M group.

Conclusion

Using CRISPR/ Cas9 editing technique to knock out PD-L1 in the drug-resistant PC-9/T790M cells can significantly improve the sensitivity of gefitinib.

Key words: CRISPR/Cas9 gene?editing technology, T790M cells, programmed cell death ligand 1, gefitinib, drug resistance sensitivity

中图分类号:

R734.2

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图/表 5

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