miR-106b靶向调控TGF-β/Smad通路对结肠癌细胞侵袭和迁移的促进作用

doi:10.13481/j.1671-587X.20210312

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨miR-106b靶向转化生长因子β受体1（TGF-βR1）对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响，阐明miR-106b与TGF-βR1基因的靶向关系及其可能作用机制。

方法

选取30例结肠癌患者癌组织和癌旁正常结肠组织、结肠癌SW-480细胞及正常结肠上皮NCM460细胞为研究对象；采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各种组织和细胞中miR-106b表达水平及细胞中TGF-βR1 mRNA表达水平。将结肠癌SW-480细胞分为空质粒组（转染miR-NC空质粒）、miR-106b组（转染miR-106b-mimics）、pGL3-TGF-βR1组（转染pGL3-TGF-βR1）和miR-106b-mimics+pGL3-TGF-βR1组（同时转染miR-106b-mimics和pGL3-TGF-βR1）；生物信息分析法预测miR-106b与TGF-βR1的靶向作用关系，荧光素酶报告实验检测各组SW-480细胞中荧光素酶活性。Transwell小室实验检测各组SW-480细胞侵袭能力，细胞划痕实验检测各组SW-480细胞划痕愈合率，Western blotting法检测各组SW-480细胞中TGF-βR1、磷酸化Smad同源物2（p-Smad2）和磷酸化Smad同源物3（p-Smad3）蛋白表达水平。

结果

结肠癌组织中miR-106b表达水平高于正常结肠组织，结肠癌SW-480细胞中miR-106b表达水平高于正常结肠上皮NCM460细胞（P<0.01）。双荧光素酶报告基因检测结果提示TGF-βR1为miR-106b的靶基因。与空质粒组比较，miR-106b组SW-480细胞中TGF-βR1 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01），侵袭细胞数和细胞划痕愈合率明显升高（P<0.01），细胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与miR-106b组比较，miR-106b-mimics+pGL3-TGF-βR1组SW-480细胞中TGF-βR1 mRNA和蛋白表达表达水平明显升高（P<0.01），侵袭细胞数和细胞划痕愈合率明显降低（P<0.01），细胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。

结论

miR-106b过表达可能通过抑制TGF-β/Smad通路促进结肠癌细胞的侵袭和迁移。

关键词: miR-106b, 转化生长因子β受体 1, 结肠肿瘤, 侵袭, 转移

Abstract: Objective

To investigate the effect of miR-106b targeting transforming growth factor-β receptor1（TGF-βR1）on the invasion and migration of colon cancer cells， and to clarify the targeting relationship between miR-106b and TGF-βR1 and its possible mechanism.

Methods

A total of 30 cases of colon cancer tissue and adjacent normal colon tissue，the colon cancer SW-480 cells and normal colon epithelial NCM460 cells were selected. The Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）method was used to detect the expression levels of miR-106b and TGF-βR1 mRNA in different kinds of tissues and cells.The colon cancer SW-480 cells were transfected and divided into empty vector group （transfected with miR-NC），miR-106b group （transfected with miR-106b-mimics），pGL3-TGF-βR1 group （transfected with pGL3-TGF-βR1）， and miR-106b-mimics+pGL3-TGF-βR1 group （transfected with miR-106b-mimics and pGL3-TGF-βR1）. The level of miR-106b in different kinds of tissues and cells，and the expression levels of TGF-βR1 mRNA in different kinds of cells were detected by RT-qPCR method；the targarc relationship between miR-106b and TGF-βR1 was predicted by bio-information analysis method.The luciferase activities of SW-480 cells in various groups were detected by luciferase reporter assay；the invasion abilities of the colon cancer SW-480 cells in various groups were detected by Transwell chamber test； the wound healing rates of the colon cancer SW-480 cells in various groups were detected by cell scratch test； the expression levels of TGF-βR1， phosphorylated Smad family member 2 （p-Smad2） and phosphorylated Smad family member 3（p-Smad3） proteins in colon cancer SW-480 cells in various groups were detected by Western blotting method.

Results

The level of miR-106b in the colon cancer tissue and colon cancer SW-480 cells were lower than those in normal colon tissue and normal colon epithelial NCM460 cells （P<0.01）.The results of double luciferase reporter gene analysis showed that TGFβR1 was the target gene of miR-106b.Compared with empty vector group，the expression levels of TGF-βR1 mRNA and protein in the colon cancer SW-480 cells in miR-106b-mimics+pGL3-TGF-βR1 group were significantly decreased（P<0.01）；the number of invasion cells and wound healing rate in the colon cancer SW-480 cells were significantly increased （P<0.01），and the expression levels of p-Smad2 and p-Smad3 proteins in the colon cancer SW-480 cells were decreased （P<0.01）.Compared with miR-106b group，the expression levels of TGF-βR1 mRNA and protein in the SW-480 cells in miR-106b-minics+PGL3-TGF-βR1 group were significantly increased（P<0.01），the number of invasion cells and the scrath healing rate were decreased（P<0.01），and the expression levels of p-Smad2 and p-Smad3 proteins in the cells were significantly increased（P<0.01）.

Conclusion

Over-expression of miR-106b may promote the invasion and migration of the colon cancer cells expression by inhibiting the TGF-β / Smad pathway.

Key words: miR-106b, transforming growth factor β receptor 1, colon neoplasms, cell invasion, cell migration

中图分类号:

R735.35

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图/表 7

表1

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图2

图3

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表２

图5

参考文献

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Group	Luciferase activity
Group	WT-TGF-βR1	MUT-TGF-βR1
Blank vector	1.12±0.09	1.09±0.12
miR-106b	0.46±0.05^*	0.99±0.11

Group	Number of invasion cells	p-Smad2 protein	p-Smad3 protein
Blank vector	169.2±12.3	1.22±0.01	1.34±0.02
miR-106b	265.4±20.3^*	0.30±0.01^*	0.23±0.01^*
pGL3-TGF-βR1	124.8±17.6^*△	2.63±0.02^*	2.54±0.12^*
miR-106b-mimics+pGL3-TGF-βR1	177.6±13.4^△#	1.51±0.06^△#	1.38±0.09^△#
F	24.521	174.532	207.348
P	<0.01	<0.01	<0.01

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