芦丁对人结肠癌SW480细胞凋亡的促进作用及其作用机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20220212

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨芦丁对人结肠癌（CRC）SW480细胞凋亡的影响，阐明芦丁在CRC治疗中的作用及其可能的分子机制。

方法

毒性与基因比较数据库（CTD）和GeneCards数据库预测与芦丁相关的交集mRNA，基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库预测交集mRNA的生物学功能及作用通路，采用String数据库寻找与Notch-1相关作用蛋白；以人CRC SW480细胞作为研究对象，分别给予0.1、1.0和10.0 μmol·L^－1 γ-分泌酶抑制剂DAPT初步筛选，进而给予1、2、4、8和10 μmol·L^－1DAPT干预，筛选出芦丁与DAPT的最适给药浓度。实验分为空白对照组、芦丁组（22 μmol·L^－1）、 DAPT组（1 μmol·L^－1）和芦丁+DAPT组（22 μmol·L^－1芦丁+1 μmol·L^－1 DAPT）；MTT法检测SW480细胞增殖活性，Hoechst33258核染色观察各组细胞凋亡形态，流式细胞术检测各组SW480细胞凋亡率，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中Notch-1 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中，Notch-1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase-3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（caspase-9）、B细胞淋巴瘤（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）的蛋白表达水平。

结果

CTD和GeneCards数据库共有芦丁的34个交集mRNA；GO和KEGG数据库预测出交集mRNA与CRC细胞凋亡过程相关；String数据库中与Notch-1相关蛋白16个［相互作用分数（score）>0.42］；芦丁与DAPT的最适给药浓度分别为22 μmol·L^－1和1 μmol·L^－1。与空白对照组比较，芦丁组、DAPT组和芦丁+DAPT组细胞凋亡率明显升高（P<0.05），细胞中Notch-1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），细胞中caspase-3、caspase-9和Bax蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。芦丁组与DAPT组细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05）。与芦丁组和DAPT组比较，芦丁+DAPT组细胞凋亡率明显升高（P<0.05），caspase-3、caspase-9和Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.05），而Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。

结论

生物信息学分析及实验研究结果均表明芦丁能促进CRC细胞凋亡，这一作用可能是通过靶向调控Notch-1调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路来实现的。

关键词: 芦丁, DAPT, 结肠肿瘤, 细胞凋亡, 丝裂原活化蛋白激酶, Notch-1

Abstract: Objective

To explore the effect of rutin on the colorectal cancer （CRC） SW480 cells， and to clarify the effect of rutin in the treatment of CRC and its possible molecular mechanism.

Methods

The Comparative Toxicogenomics（CTD） and GeneCards databases were used to predict the intersection mRNA related to rutin； Gene Ontdogy（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genones（KEGG） databases were used to predict the biological function and action pathways of the intersection mRNA； String database was used to find the Notch-1 related proteins. The human CRC SW480 cells were used as the subjects， 0.1， 1.0， and 10.0 μmol·L^－1 DAPT were given for preliminary screening， then 1， 2， 4， 8 and 10 μmol·L^－1 DAPT were given to intervene， and the optimal concentrations of rutin and DAPT were screened out. The human CRC SW480 cells were divided into blank control group， rutin group （22 μmol·L^－1）， DAPT group （1 μmol·L^－1） and rutin+DAPT group（22 μmol·L^－1 rutin+1 μmol·L^－1 DAPT）.MTT method was used to detect the cell proliferation activities； Hoechst33258 nuclear staining was used to observe the apopotic morphology of cells，and flow cytometry was used to detect the apoptotic rates；real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） method was performed to detect the expression levels of Notch-1 mRNA in the SW480 cells in various groups； Western blotting method was used to determine the protein expression levels of Notch-1，caspase-3，caspase-9，B-cell lymphoma 2（Bcl-2），and Bcl-2 associated X protein in the SW480 cells in various groups.

Results

In CTD and GeneCards databases， there were a total of 34 intersection mRNA；the GO and KEGG databases predicted that the intersection mRNA was related to the process of colon cancer apoptosis； String database verified 16 Notch-1 related proteins （score>0.42）； the optimal administration concentrations of rutin and DAPT were 22 μmol·L^－1 and 1 μmol·L^－1； compared with blank control group， the apoptotic rates in rutin group， DAPT group and rutin+DAPT group were increased significantly （P<0.05）， the expression levels of Notch1 mRNA and protein were significantly reduced （P<0.05）， the expression levels of caspase-3， caspase-9， and Bax proteins in the cells were increased significantly（P<0.05）， while the expression levels of Bcl-2 protein were decreased significantly （P<0.05）. There was no significant difference in the apoptotic rate between rutin group and DAPT group （P>0.05）. Compared with rutin group and DAPT group， the apoptotic rate in rutin+DAPT group was significantly increased（P<0.05）， the expression levels of caspase-3， caspase-9， and Bax proteins were increased significantly（P<0.05），while the expression level of Bcl-2 protein was decreased significantly（P<0.05）.

Conclusion

The results of bioinformatics analysis and experiment show that rutin can promote the apoptosis of CRC cells， which may be achieved by targeting Notch-1 and regulating MAPK signal pathway.

Key words: Rutin, DAPT, Colon neoplasms, Apoptosis, Mitogen-activated protein kinase, Notch-1

中图分类号:

R735.35

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图/表 10

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参考文献 25

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Group	Notch-1/GAPDH
Blank control	1.000±0.000
DAPT(μmol·L^－1)
0.1	0.693±0.038^*
1.0	0.303±0.071^*
10.0	0.160±0.010^*

Group	Proliferation activity
Blank control	1.307±0.031
DAPT(μmol·L^－1)
1	1.113±0.081^**
2	0.907±0.031^**
4	0.820±0.087^*
8	0.667±0.021^**
10	0.547±0.035^**

Group	Proliferation activity
Blank control	1.178±0.120
Rutin(μmol·L^－1)
5	0.675±0.103^*
15	0.648±0.113^*
45	0.561±0.086^*
135	0.473±0.083^*
405	0.280±0.070^*

Group	Apoptotic rate
Blank control	0
Rutin	5.470±0.630^*
DAPT	7.097±0.571^*
Rutin +DAPT	13.567±1.294^*△#

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