实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价
张力文1,2，王宗润1,2，吴秀丽2,3，房明丽2,3，张云峰1,2
- 1.吉林大学第一医院小儿呼吸一科，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院儿科研究
所，吉林 长春130021；3.吉林大学基础医学院分子生物学教研室，吉林 长春130021
Establishment and evaluation of detection method of bifidobacteria in human fecal using real-time fluorescence quantitative PCR
ZHANG Li-wen1,2,WANG Zong-run1,2,WU Xiu-li2,3,FANG Ming-li2,3,ZHANG Yun-feng1,2
- 1.Department of Pediatrics Respiratory Medicine,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China；2. Institute of Pediatrics,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 3. Department of Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China
摘要：
目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法，为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细 菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区，依据双歧杆菌的16SrRNA序列共设计3条引物，以常规PCR扩增出的16SrRNA部分基因片段制作标准品，应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品及待测样本进行分析，建立绝对定量的标准曲线，同时计算出待测样本双歧杆菌浓度；根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度；分析PCR产物熔解曲线评价反应特异性；重复检测梯度稀释的标准品，用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp，测序结果正确，成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品；生成的标准曲线R2=0.999，最低检测限度为每个反应1.48×102个拷贝；实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量PCR检测，各组间每微升1.48×103~1.48×107个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94%、3.39%、3.54%、3.08%和3.34%。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数?g-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量PCR法敏感性高、特异性强，且重复性好，适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。
中图分类号: