肌肽对脂多糖诱导星形胶质细胞炎症因子释放的抑制作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20210211

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨肌肽对脂多糖（LPS）诱导的星形胶质细胞（AS）炎症因子释放的影响，初步阐明其作用机制。

方法

体外培养新生大鼠大脑皮质AS并纯化，随机分为对照组、LPS组和LPS+肌肽组（10、30和90 mmol·L^－1肌肽）。对照组只加入完全培养基，LPS组培养基中加入终浓度为1 mg·L^－1 LPS，体外刺激细胞 24 h构建炎症损伤模型，LPS+肌肽组培养基中预先分别加入10、30和90 mmol·L^－1肌肽，培养1 h后再加入终浓度为1 mg·L^－1 的LPS。MTT法检测各组AS存活率，ELISA法检测各组AS培养液中白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，DCFH-DA探针法检测各组AS中活性氧（ROS）水平，Hoechst 33258荧光染色法检测各组AS凋亡率，免疫荧光染色法测定各组AS中磷酸化核转录因子κB p65（p-NF-κB p65）蛋白表达情况和p-NF-κB p65阳性细胞数，采用Western blotting 法检测各组AS中p-NF-κB p65蛋白表达水平。

结果

与对照组比较，LPS组AS存活率明显降低（P<0.05），AS培养液中IL-1β和TNF-α水平升高（P<0.05），AS中ROS水平、AS凋亡率和p-NF-κB p65阳性细胞数均明显升高（P<0.05），AS中p-NF-κB p65蛋白表达水平升高（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+肌肽组AS存活率明显升高（P<0.05），AS培养液中IL-1β和TNF-α水平降低（P<0.05），AS中ROS水平、AS凋亡率和p-NF-κB p65阳性细胞数均明显降低（P<0.05），AS中p-NF-κB p65蛋白表达水平降低（P<0.05）。

结论

肌肽可抑制LPS引起的AS中炎症因子IL-1β和TNF-α释放，其机制可能与肌肽抑制LPS诱导AS中ROS生成、进而抑制NF-κB p65激活有关。

关键词: 肌肽, 脂多糖, 星形胶质细胞, 炎症因子, 核转录因子κB p65

Abstract: Objective

To investigate the effect of carnosine on the inflammatory cytokine release in the astrocytes （AS） induced by lipopolysaccharide （LPS）， and to clarify its mechanism.

Methods

The neonatal rat cerebral cortex AS were cultured and purified in vitro. The AS were randomly divided into control group， LPS group and LPS+carnosine groups （10，30，and 90 mmol·L^-1 carnosine ）.The cells in control group were only cultured with complete medium； the cells in LPS group were stimulated in vitro with 1 mg·L^－1LPS for 24 h to construct the inflammatory injury model； the cells in LPS+carnosine groups were cultured with 10，30， and 90 mmol·L^－1carnosine， respectively； in complete medium for 1 h， then treated with LPS with a final concentration of 1 mg·L^－1 for 24 h.The survival rates of AS in various groups were determined by MTT assay. The levels of interleukin-1β（IL-1β） and tumor necrosis factor-α（TNF-α） in the AS culture medium were detected by ELISA. DCFH-DA fluorescence probe was used to detect the reactive oxygen species（ROS） levels in AS in various groups； Hoechst 33258 fluorescence staining was used to detect the apoptotic rates of AS in various groups. The expressions of phosphorylated nuclear transcription factor-κB p65（p-NF-κB p65） in the AS and the number of p-NF-κB p65 positive cells in various groups were determined by immunofluorescence staining. The expression levels of p-NF-κB p65 protein in the AS in various groups were detected by Western blotting method.

Results

Compared with control group， the survival rate of AS in LPS group was significantly decreased（P<0.05）， the levels of IL-1β and TNF-α in AS culture medium were increased（P<0.05）， the ROS level in AS was significantly increased（P<0.05），the apoptotic rate and the number of p-NF-κB p65 positive AS were increased significantly（P<0.05），and the expression level of p-NF-κB p65 protein in the AS was increased（P<0.05）.Compared with LPS group， the survival rates of AS in LPS+carnosine groups were significantly increased（P<0.05）， the levels of IL-1β and TNF-α in AS culture medium were decreased（P<0.05）， the ROS levels in the AS were decreased（P<0.05）， the apoptotic rates and the number of p-NF-κB p65 positive AS were decreased significantly（P<0.05），and the expression levels of p-NF-κB p65 protein in the AS were decreased（P<0.05）.

Conclusion

Carnosine can inhibit the release of the inflammatory factors IL-1β and TNF-α in the AS induced by LPS， and its mechanism may be related to inhibiting the ROS production in AS induced by LPS and then inhibiting the activation of NF-κB p65.

Key words: carnosine, lipopolysaccharide, astrocyte, inflammatory factor, nuclear transcription factor κB p65

中图分类号:

白雪,于露,杨文强,何鑫,杨新生,杨菁. 肌肽对脂多糖诱导星形胶质细胞炎症因子释放的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(2): 330-337.

Xue BAI,Lu YU,Wenqiang YANG,Xin HE,Xinsheng YANG,Jing YANG. Inhibitory effect of carnosine on LPS-induced inflammatory cytokine release in astrocytes and its mechanism[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2021, 47(2): 330-337.

图/表 8

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参考文献 21

1	KIM Y，KIM Y. L-histidine and L-carnosine exert anti-brain aging effects in D-galactose-induced aged neuronal cells［J］. Nutrition Res Pract，2020，14（3）：188-202.
2	杨文强，何鑫，杨菁，等.肌肽对血管性认知障碍大鼠氧化应激及NF-κB信号途径的影响［J］.吉林大学学报（医学版），2020，46（2）：329-334.
3	AHSHIN-MAJD S，ZAMANI S，KIAMARI T， et al. Carnosine ameliorates cognitive deficits in streptozotocin-induced diabetic rats： Possible involved mechanisms［J］. Peptides， 2016， 86：102-111.
4	赵丹婷，刘影，赵艳，等. 肌肽对糖尿病大鼠海马中氧化应激及NF-κB信号通路的影响［J］. 中国临床解剖学杂志， 2018， 36（5）：514-519.
5	LIN A H，LIU J， GONG P， et al. Serum amyloid A inhibits astrocyte migration via activating p38 MAPK［J］. J Neuroinflammation，2020， 17（1）：254.
6	张慧宇，郭敏芳，于婧文，等. 法舒地尔（Fasudil）抑制脂多糖诱导的小鼠星形胶质细胞活化和炎性反应及其机制［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2018， 34（6）：29-34.
7	TRUJIILLO-ESTRADA L，GOMEZ-ARBOLEDAS A，FORNER S，et al. Astrocytes： from the physiology to the disease［J］. Curr Alzheimer Res，2019，16（8）：675-698.
8	KAEWMOOL C， UDOMRUK S， PHITAK T，et al. Cyanidin-3-O-glucoside protects PC12 cells against neuronal apoptosis mediated by LPS-stimulated BV2 Microglial activation［J］. Neurotox Res， 2020， 37（1）：111-125.
9	OUYANG L ， TIAN Y Y ， BAO Y ， et al. Carnosine decreased neuronal cell death through targeting glutamate system and astrocyte mitochondrial bioenergetics in cultured neuron/astrocyte exposed to OGD/recovery［J］. Brain Res Bull， 2016， 124：76-84.
10	庞磊，杨岳，杨菁，等.高糖对高钾刺激引起新生大鼠星形胶质细胞谷氨酸释放和再摄取的影响［J］.中国药理学与毒理学杂志，2012，26（2）：163-167.
11	SUN Y， GE X， LI M， et al. Dyrk2 involved in regulating LPS-induced neuronal apoptosis［J］.Int J Biol Macromol， 2017，104（pt a）：929-986.
12	HAN X， ZHANG T，LIU H，et al.Astrocyte senescence and Alzheimer's disease： a review［J］. Front Aging Neurosci， 2020， 12：148.
13	SOFRONIEW M V. Astrocyte barriers to neurotoxic inflammation［J］. Nat Rev Neurosci，2015，16（5）：249-263.
14	WANG J Y，LIU Z Y，WANG X， et al. Isoflurane Regulates Proliferation， Apoptosis， and Inflammatory Response of Lipopolysaccharide-Induced Human Astrocyte through the miR-206/BDNF Axis［J］. Int J Polym Sci，2020，2020：1-8.
15	NIKAIDO H. Molecular Basis of bacterial outer membrane permeability revisited［J］. Microbiol Mol Biol Rev， 2003，67（4）：593-656.
16	LIN S T， WANG Y， XUE Y， et al. Tetrandrine suppresses LPS-induced astrocyte activation via modulating IKKs-IκBα-NF-κB signaling pathway［J］. Mol Cell Biochem， 2008， 315（1/2）： 41-49.
17	ROSENBERGER J， PETROVICS G， BUZAS B. Oxidative stress induces proorphanin FQ and proenkephalin gene expression in astrocytes through p38-and ERK-MAP kinases and NF-kappaB［J］.J Neurochem，2008，79（1）：35-44.
18	KUMAR D， SINGLA S K， PURI V，et al. The restrained expression of NF-κB in renal tissue ameliorates folic acid induced acute kidney injury in mice［J］. PLoS One，2015，10（1）：e115947.
19	TIAN Y L， MA J T ， WANG W D， et al. Resveratrol supplement inhibited the NF-κB inflammation pathway through activating AMPKα-SIRT1 pathway in mice with fatty liver［J］. Mol Cell Biochem， 2016， 422（1/2）：75-84.
20	SUN T，LUO J，JIA M，et al.Small interfering RNA-mediated knockdown of NF-κB p65 attenuates neuropathic pain following peripheral nerve injury in rats［J］. Eur J Pharmacol， 2012， 682（1-3）：79-85.
21	NGUYEN T Q C， BINH T D， KUSUNOKI R，et al.Effects of Launaea sarmentosa extract on lipopolysaccharide-induced inflammation via suppression of NF-κB/MAPK signaling and Nrf2 activation［J］. Nutrients， 2020，12（9）：2586.

Group	Dose[c_B/(mmol·L^－1)]	TNF-α	IL-1β
Control	－	49.8±9.4	44.5±3.9
LPS	－	172.7±7.3^*	159.2±13.5^*
LPS+carnosine	10	129.3±7.9 ^△	110.0±12.3^△
	30	89.1±7.3 ^△	68.9±8.6 ^△
	90	57.3±5.6 ^△	47.7±8.8 ^△

[1]	龙光文,张谦,杨秀林,吉春玲,董裕康. miR-146b对急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织中ICAM-1表达的调控作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 587-594.
[2]	谢磊,刘晓丽,葛静,李亚威. 黄芩苷联合二甲双胍对多囊卵巢综合征大鼠内分泌、炎症因子和胰岛素抵抗的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 623-629.
[3]	张淑荣,张琦颖. 木犀草素通过TLR4/MyD88信号通路对大鼠烟曲霉菌性角膜炎的调控作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(2): 315-322.
[4]	韦伟,轩妍,黄晓燕. 西地那非对支气管肺发育不良新生大鼠的治疗作用及HIF-1α/2α-VEGF通路机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(2): 414-420.
[5]	刘琪,张显晨,李香雨,林钰淼,杨颜齐,闫恩志. 氯化锂对Aβ_1-42引起的星形胶质细胞谷氨酸释放的抑制作用及其对海马神经元损伤的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(1): 35-43.
[6]	杨吉平, 费琳, 柴学军, 苟兴春. MyD88抑制肽对LPS诱导BV2小胶质细胞极化状态的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 899-904.
[7]	李伟, 张海峰, 王淼, 霍静, 张颖, 赵翠. 黄芪注射液对睡眠剥夺大鼠心脏的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 998-1003.
[8]	裴丹, 刘学. 抑制PDGFRα活化对小鼠脑损伤后胶质细胞增殖和瘢痕形成的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 1023-1028.
[9]	毕勇志, 马芬, 时俊霞, 宋琳琳, 李林泽. 大黄素对大鼠局灶性脑缺血的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(03): 569-574.
[10]	陈州华, 龚辉, 冯磊, 肖玉洁, 黄立中. LPS对乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮间质转化的诱导作用及其对β-catenin表达的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(02): 309-315.
[11]	杨文强, 何鑫, 白雪, 于露, 李宗泽, 张家悦, 杨菁. 肌肽对血管性认知障碍大鼠氧化应激及NF-κB信号途径的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(02): 329-334.
[12]	杜兴旭, 乔子敬, 杨硕, 许智莹, 杨波, 李贺, 陈建光, 王春梅. 五味子多糖对2型糖尿病大鼠血清中炎症因子的影响及其作用机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(01): 50-55.
[13]	郭向辉, 郑慧, 吴巍. 白头翁皂苷B4对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(01): 90-95.
[14]	张宸豪, 李瑶, 李正祎, 骆晓峰. 原花青素B1对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7损伤的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(06): 1243-1247.
[15]	梁小波, 吴德洪, 王星, 张沄, 王孝芸, 李国平. 鼻内滴注烟草提取物和脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的评价[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(06): 1454-1458.