柯萨奇病毒A16型病毒Vp1蛋白的原核表达、纯化及兔多克隆抗体的制备

doi:10.13481/j.1671-587X.20250629

吉林大学学报(医学版) ›› 2025, Vol. 51 ›› Issue (6): 1717-1727.doi: 10.13481/j.1671-587X.20250629

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柯萨奇病毒A16型病毒Vp1蛋白的原核表达、纯化及兔多克隆抗体的制备

王家宁^1,²,刘永娟³,冉凯凯⁴,孙宾莲^1,²,史颖颖^1,²()

^1.江汉大学湖北省认知与情感障碍重点实验室，湖北武汉 430056
^2.江汉大学基础医学院免疫学教研室，湖北武汉 430056
^3.徐州医科大学附属连云港市第一人民医院中心实验室，江苏连云港 222002
^4.武汉迈思生物科技有限公司，湖北武汉 430206

收稿日期:2024-11-25 接受日期:2025-01-16 出版日期:2025-11-28 发布日期:2025-12-15
通讯作者: 史颖颖 E-mail:shiyingyinga@126.com
作者简介:王家宁（1999-），女，山东省临沂市人，在读硕士研究生，主要从事抗肠道病毒药物筛选方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金项目(82202494);湖北省科技厅自然科学基金项目(2018CFB254);湖北省武汉市卫健委新冠肺炎应急科研专项项目(EX20D04);江汉大学校级科研资助计划项目(2023KJZX27)

Prokaryotic expression, purification of coxsackievirus A16 Vp1 protein and preparation of rabbit polyclonal antibodies

Jianing WANG^1,²,Yongjuan LIU³,Kaikai RAN⁴,Binlian SUN^1,²,Yingying SHI^1,²()

^1.Hubei Provincial Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorders，Jianghan University，Wuhan 430056，China
^2.Department of Immunology，School of Basic Medical Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，China
^3.Central Laboratory，Affiliated First People’s Hospital，Lianyungang City，Xuzhou Medical University，Lianyungang 222002，China
^4.Wuhan Mabnus Biotechnology Co. Ltd. ，Wuhan 430206，China

Received:2024-11-25 Accepted:2025-01-16 Online:2025-11-28 Published:2025-12-15
Contact: Yingying SHI E-mail:shiyingyinga@126.com

摘要/Abstract

摘要：

目的构建柯萨奇病毒A16型（CA16）病毒病毒蛋白1（Vp1）的原核表达载体，并在大肠杆菌（E.coli）BL21中进行表达，纯化蛋白后制备兔多克隆抗体并对抗体免疫反应性进行鉴定。方法利用生物信息学在线工具对Vp1蛋白氨基酸组成、保守结构域、二级和三级结构进行预测。扩增CA16的Vp1基因，并将其克隆至原核表达载体pET28a（+）中。将pET28a-Vp1转化E.coli BL21，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。采用Western blotting法鉴定Vp1蛋白诱导表达情况，并优化诱导时间和温度以提高表达效率。取2只雌性SPF新西兰大白兔，将纯化的重组蛋白Vp1免疫兔，制备兔抗Vp1蛋白多克隆抗体，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定抗体效价，Western blotting法对抗体的免疫反应性进行鉴定。结果生物信息学分析，Vp1基因编码297个氨基酸，相对分子质量为33 046.39，等电点为8.32，属于亲水性蛋白；二级结构中α-螺旋占15.15%，无规则卷曲占67.68%，延伸链占17.17%。重组质粒pET28a-Vp1测序，pET28a-Vp1质粒构建正确。Western blotting法检测，IPTG诱导组于相对分子质量33 000处有目的蛋白表达，目的蛋白主要表达于包涵体中。蛋白最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.4 mmol·L^-1、温度16 ℃和诱导时间20 h。ELISA法检测，兔多克隆抗体效价为1∶1 024 000。Western blotting法检测，Vp1兔多克隆抗体可以与CA16感染细胞中的病毒Vp1蛋白结合。结论成功制备出抗CA16 Vp1的多克隆抗体，该抗体对CA16 Vp1具有明显的结合特性，可用于肠道病毒感染的诊断及治疗方法的开发。

关键词: 柯萨奇病毒A16型, 病毒蛋白1, 原核表达, 多克隆抗体, 大肠杆菌

Abstract:

Objective To construct the prokaryotic expression vector of Coxsackievirus A16 （CA16） viral protein 1 （Vp1）， express it in Escherichia coli （E.coli） BL21， purify the protein， prepare rabbit polyclonal antibodies， and identify the immunoreactivity of the antibodies. Methods Bioinformatics online tools were used to predict the amino acid composition， conserved domains， secondary and tertiary structures of the Vp1 protein. The Vp1 gene of CA16 was amplified and cloned into the prokaryotic expression vector pET28a（+）. The pET28a-Vp1 was transformed into E.coli BL21， and the expression was induced using isopropyl β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）. Western blotting method was used to identify the induced expression of Vp1 protein， and the induction time and temperature were optimized to improve the expression efficiency. Two female SPF New Zealand white rabbits were taken， and the purified recombinant protein Vp1 was used to immunize the rabbits to prepare rabbit anti-Vp1 protein polyclonal antibodies. The antibody titer was determined by ELISA method， and the immunoreactivity of the antibodies was identified by Western blotting method. Results The bioinformatics analysis results showed that the Vp1 gene encoded 297 amino acids， with a relative molecular mass of 33 046.39 and an isoelectric point of 8.32， belonging to a hydrophilic protein； in the secondary structure， α-helix accounted for 15.15%， random coil accounted for 67.68%， and extended strand accounted for 17.17%. Sequencing of the recombinant plasmid pET28a-Vp1 confirmed that the pET28a-Vp1 plasmid was correctly constructed. The Western blotting results showed that the target protein was expressed in the IPTG induction group at a relative molecular mass of 33 000， and the target protein was mainly expressed in inclusion bodies. The optimal induction conditions for protein expression were IPTG concentration of 0.4 mmol·L^-1， temperature of 16 ℃， and induction time of 20 h. The ELISA assay results showed that the titer of the rabbit polyclonal antibody was 1∶1 024 000. The Western blotting results showed that the Vp1 rabbit polyclonal antibody could bind to the viral Vp1 protein in the CA16-infected cells. Conclusion The polyclonal antibody against CA16 Vp1 is successfully prepared， and this antibody has significant binding characteristics to CA16 Vp1， which can be used for the diagnosis of enterovirus infection and the development of treatment methods.

Key words: Coxsackievirus A16, Viral protein 1, Prokaryotic expression, Polyclonal antibody, Escherichia coli

中图分类号:

R373.2

王家宁,刘永娟,冉凯凯,孙宾莲,史颖颖. 柯萨奇病毒A16型病毒Vp1蛋白的原核表达、纯化及兔多克隆抗体的制备[J]. 吉林大学学报(医学版), 2025, 51(6): 1717-1727.

Jianing WANG,Yongjuan LIU,Kaikai RAN,Binlian SUN,Yingying SHI. Prokaryotic expression, purification of coxsackievirus A16 Vp1 protein and preparation of rabbit polyclonal antibodies[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2025, 51(6): 1717-1727.

图/表 13

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参考文献 32

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Amino acid	Number[n （η/%）]	Amino acid	Number[n （η/%）]
Alanine (A)	23（7.7）	Leucine (L)	20（6.7）
Arginine (R)	15（5.1）	Lysine (K)	11（3.7）
Asparagine (N)	19（6.4）	Methionine (M)	10（3.4）
Aspartic acid (D)	15（5.1）	Phenylalanine (F)	13（4.4）
Cysteine (C)	4（1.3）	Proline (P)	22（7.4）
Glutamine (Q)	15（5.1）	Serine (S)	20（6.7）
Glutamic acid (E)	9（3.0）	Threonine (T)	30（10.1）
Glycine (G)	17（5.7）	Tryptophan (W)	4（1.3）
Histidine (H)	6（2.0）	Tyrosine (Y)	12（4.0）
Isoleucine (I)	13（4.4）	Valine (V)	19（6.4）

Group	Titer of rabbit polycolonal antibody
Group	Control	1 000	2 000	4 000	8 000	16 000	32 000	64 000	128 000	256 000	512 000	1 024 000
Group A	0.091	2.025	2.002	1.937	1.847	1.728	1.438	1.186	0.819	0.538	0.413	0.237
Group B	0.069	2.064	1.995	1.972	1.968	1.804	1.614	1.366	1.036	0.696	0.443	0.378

柯萨奇病毒A16型病毒Vp1蛋白的原核表达、纯化及兔多克隆抗体的制备

Prokaryotic expression, purification of coxsackievirus A16 Vp1 protein and preparation of rabbit polyclonal antibodies

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