雌二醇联合1，25-二羟维生素D3对绝经后骨质疏松症大鼠的治疗作用

doi:10.13481/j.1671-587X.20210406

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨雌二醇联合1，25-二羟维生素D3［1，25（OH）₂D₃］对绝经后骨质疏松症（PMOP）大鼠的治疗作用，并阐明其作用机制。

方法

40只雌性SD大鼠随机分为对照组、骨质疏松症模型组（模型组）、卵巢去势后雌二醇干预组（雌二醇组）和卵巢去势后雌二醇联合1，25（OH）₂D₃组［雌二醇联合1，25（OH）₂D₃组］，每组10只，连续喂养24周后取大鼠血清，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组大鼠血清中成骨标志物碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）、骨保护素（OPG）、Ⅰ型前胶原氨基端原肽（PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）和骨吸收标志物核因子κB受体活化因子配体（RANKL）水平。取大鼠双侧股骨，采用HE和TRAP染色观察大鼠骨组织形态表现，采用骨密度仪和力学生物仪检测各组大鼠股骨骨密度（BMD）和骨组织弹性模量、刚度、最大应力及最大承受力。取大鼠双侧胫骨，采用逆转录PCR（RT-PCR）法和Western blotting法检测各组大鼠骨组织中ALP、OC、OPG及RANKL mRNA和蛋白表达水平。

结果

与对照组比较，模型组大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平明显升高（P<0.01）；大鼠骨膜厚度明显增加，破骨细胞数量增多且骨外膜下可见少许点状虫蚀状缺损，呈现典型骨质疏松特点；大鼠股骨BMD和生物力学指标明显降低（P<0.01），骨组织中ALP、OC、OPG及RANKL mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。与模型组比较，雌二醇联合1，25（OH）₂D₃组大鼠血清中ALP、PINP、TRACP和RANKL水平明显降低（P<0.01），OPG/RANKL比值明显升高（P<0.01）；骨膜内成骨细胞增生活跃，且骨膜下无虫蚀状缺损；大鼠股骨BMD和生物力学指标明显升高（P<0.01），骨组织中ALP、OC及RANKL mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与雌二醇组比较，雌二醇联合1，25（OH）₂D₃组大鼠血清中OC和OPG水平及OPG/RANKL比值明显升高（P<0.01），TRACP和RANKL水平明显降低（P<0.01），大鼠股骨BMD和生物力学指标中弹性模量及最大应力明显升高（P<0.01），骨组织中OPG mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01），RANKL　mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。

结论

雌二醇联合1，25（OH）₂D₃能更有效地促进大鼠成骨细胞的增殖和分化，二者联合应用可在治疗PMOP的同时降低过量激素替代导致的不良反应发生率。

关键词: 绝经后骨质疏松症, 成骨细胞, 雌二醇, 1,25-二羟维生素D3, 骨密度

Abstract: Objective

To investigate the effect of estradiol combined with 1， 25-dihydroxyvitamin D3［1，25（OH）₂D₃］ in the postmenopausal osteoporosis （PMOP） rats， and to clarify its mechanism.

Methods

Forty female SD rats were randomly divided into control group， osteoporosis model group （model group），ovarian castratiom and estradiol intervention group （estradiol group），ovarian castration and estradiol combined with 1， 25-（OH）₂D₃ group （estradiol combined with 1， 25 （OH）₂D₃ group）；there were 10 rats in each group.The serum of rats were collected after 24 weeks of feeding， and the levels of alkaline phosphatase （ALP）， osteocalcin （OC），osteoprotectin （OPG），amino-end peptide of type Ⅰ procollagen （PINP），tartrate-resistant acid phosphatase （TRACP） and nuclear factor kappa B receptor activator ligand （RANKL） were detected by ELISA method.Bilateral femurs were taken and the changes of bone tissue were observed by HE and TRAP staining. The elastic modulus， stiffness， maximum stress， maximum lord and bone mineral density （BMD） of bone tissue of the rats in each group were detected by biomechanics and BMD. The mRNA and protein expression levels of ALP， OC， OPG and RANKL in bone tissue of the rats in various groups were detected by RT-PCR and Western blotting methods.

Results

Compared with control group，the levels of serum ALP，OC，OPG，PINP，TRACP and RANKL were significantly increased（P<0.01），the periosteum thickness was increased，the number of osteoclasts was increased，and a little of punctate inset-etched defect was found under periosteum，presenting the typical features of osteoporosis； the biomechanical index and BDM of femurs were decreased（P<0.01），the expression levels of ALP，OC，OPG，and RANKL mRNA and proteins in bone tissue were significantly increased（P<0.01）.Compared with model group，the levels of serum ALP，PINP，TRACP，and RANKL of the rats in estradiol combined with 1，25（OH）₂D₃ group were significantly decreased（P<0.01），the ratio of OPG/RANKL was increased（P<0.01），the osteoclasts in periosteum were proliferated actively，and there was no punctate inset-etched defect；the BMD of femurs of the rats and the biomechrical indexes were significantly increased（P<0.01），and the expression levels of ALP，OC and RANKL mRNA and proteins in bone tissue of the rats were decreased（P<0.01）.Compared with estradiol group，the levels of serum OC and OPG of the rats in estradiol combined with 1，25（OH）₂D₃ group and the ratio of OPG/RANK were increased（P<0.01），the levels of TRACP and RNAKL were significantly decreased（P<0.01），the BMD of femurs and the biomechical indexes elastic modulus and maximum stress were significantly increased（P<0.01），the expression levels of OPG mRNA and protein in bone tissue were increased（P<0.01），and the expression levels of RANKL mRNA and protein were significantly decreased（P<0.01）.

Conclusion

Estradiol combined with 1，25（OH）₂D₃ is more effective in promoting the proliferation and differentiation of osteoblasts， and the combination can reduce the adverse reactions caused by excessive hormone replacement while treating PMOP.

Key words: postmenopausal osteoporosis, osteoblast, estradiol, 1，25-dihydroxyvitamin D3, bone mineral density

中图分类号:

R592

李希宁,翁伟,沈哲源,豆晓杰,闵继康. 雌二醇联合1，25-二羟维生素D3对绝经后骨质疏松症大鼠的治疗作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(4): 857-864.

Xining LI,Wei WENG,Zheyuan SHEN,Xiaojie DOU,Jikang MIN. Therapeutic effect of estradiol combined with 1,25-dihydroxyvitamin D3 on postmenopausal osteoporosis in rats[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2021, 47(4): 857-864.

图/表 8

表1

表2

图1

图2

表3

表4

图3

图4

参考文献 21

1	WANG W， WANG Z P， HUANG C Y， et al. The neuropeptide vasoactive intestinal peptide levels in serum are inversely related to disease severity of postmenopausal osteoporosis： a cross-sectional study［J］. Genet Test Mol Biomarkers，2019，23（7）： 480-486.
2	OLÍMPIO R M C， MORETTO F C F， DE SIBIO M T，et al. The importance of estrogen for bone protection in experimental hyperthyroidism in human osteoblasts［J］. Life Sci， 2019， 231： 116556.
3	JIANG M， WANG T， YAN X， et al. A novel Rhein derivative modulates bone formation and resorption and ameliorates estrogen-dependent bone loss［J］. J Bone Miner Res， 2019， 34（2）： 361-374.
4	BARABÁSI B， CSONDOR A， MARTÍN-POZAS T， et al. Effect of axotomy and 17β-estradiol on P2X7 receptor expression pattern in the hypoglossal nucleus of ovariectomized mice［J］. Neuroscience， 2016， 319： 107-115.
5	NGUYEN-YAMAMOTO L， TANAKA K I， STARNAUD R， et al. Vitamin D-regulated osteocytic sclerostin and BMP2 modulate uremic extraskeletal calcification［J］. JCI Insight， 2019， 4（13）：e126467.
6	GLOUX A， LE ROY N， EZAGAL J， et al. Possible roles of parathyroid hormone，1.25（OH）₂D₃，and fibroblast growth factor 23 on genes controlling calcium metabolism across different tissues of the laying hen［J］. Domest Anim Endocrinol， 2020， 72：106407.
7	BACHMANN H， LANZ M， KEHRLE S， et al. Effects of a sustained release formulation of 1，25-dihydroxyvitamin D3-glycosides for milk fever prevention on serum 1，25-dihydroxyvitamin D3，calcium and phosphorus in dairy cows［J］. J Steroid Biochem Mol Biol， 2017， 173：301-307.
8	MCCABE L R， IRWIN R， TEKALUR A， et al. Exercise prevents high fat diet-induced bone loss， marrow adiposity and dysbiosis in male mice［J］. Bone， 2019， 118： 20-31.
9	MARCHENKOVA L A， MAKAROVA E V， VASILIEVA V A， et al. The effect of basic therapy with calcium and vitamins D3 and B6 on muscle strength， movement and balance functions at patients with osteoporosis undergoing medical rehabilitation［J］. Vopr Kurortol Fizioter Lech Fiz Kult，2020，97（1）： 25-34.
10	CHEN X， WANG Z， DUAN N， et al. Osteoblast-osteoclast interactions［J］. Connect Tissue Res， 2018， 59（2）：99-107.
11	SEKIGUCHI Y， MANO H， NAKATANI S， et al. Mangiferin positively regulates osteoblast differentiation and suppresses osteoclast differentiation［J］. Mol Med Rep， 2017， 16（2）： 1328-1332.
12	PARK S， KANG S N， KIM D S. Severe calcium deficiency increased visceral fat accumulation， down-regulating genes associated with fat oxidation， and increased insulin resistance while elevating serum parathyroid hormone in estrogen-deficient rats［J］. Nutr Res， 2020， 73： 48-57.
13	RAMCHAND S K， SEEMAN E， WANG X F， et al. Premenopausal women with early breast cancer treated with estradiol suppression have severely deteriorated bone microstructure［J］. Bone， 2017， 103：131-135.
14	KÄGI L， BETTONI C， PASTOR-ARROYO E M，et al.Regulation of vitamin D metabolizing enzymes in murine renal and extrarenal tissues by dietary phosphate， FGF23， and 1，25（OH）₂D₃ ［J］. PLoS One， 2018， 13（5）：e0195427.
15	NICKOLAS T L， YIN M T， HONG T， et al. Impact of tenofovir-based pre-exposure prophylaxis on biomarkers of bone formation， bone resorption， and bone mineral metabolism in HIV-negative adults［J］. Open Forum Infect Dis， 2019， 6（10）： ofz338.
16	CAO S， WASTNEY M E， LACHCIK P J， et al. Both oleanolic acid and a mixture of oleanolic and ursolic acids mimic the effects of fructus ligustri lucidi on bone properties and circulating 1， 25-dihydroxycholecalciferol in ovariectomized rats［J］. J Nutr， 2018， 148（12）： 1895-1902.
17	LI Z F， CAO L H， WANG Y， et al. Inhibitory effect of 1， 25-dihydroxyvitamin D₃ on Porphyromonas gingivalis-induced inflammation and bone resorption in vivo ［J］. Arch Oral Biol， 2016， 72： 146-156.
18	LORENTZON M， BRANCO J， BRANDI M L， et al. Algorithm for the use of biochemical markers of bone turnover in the diagnosis， assessment and follow-up of treatment for osteoporosis［J］.Adv Ther， 2019，36（10）： 2811-2824.
19	CHAKI O. Calcium and bone metabolism across women’s life stages. Changes of biochemical markers of bone turnover in life cycle of women［J］. Clin Calcium， 2017， 27（5）： 623-633.
20	MUSCHITZ C， FEICHTINGER X， HASCHKA J，et al.Diagnosis and treatment of Paget’s disease of bone：a clinical practice guideline［J］. Wien Med Wochenschr， 2017， 167（1/2）：18-24.
21	AKKAWI I， ZMERLY H. Osteoporosis： current concepts［J］. Joints， 2018， 6（2）：122-127.

Primer		Sequence	Size（bp）
ALP	F	5'-TGCCCTGAAACTCCAAAAGC-3'	215
	R	5'-CTTCACGCCACACAAGTAGG-3'
OC	F	5'-CGCTACTGTGTCTTGGCATC-3'	168
	R	5'-GGTTCATGCTGCTTAGTCGG-3'
OPG	F	5'-AGGGTTTCATTCCAGGATCGAGC-3'	186
	R	5'-CGGGAGAACAGGGTATGA-3'
RANKL	F	5'-CGGGAGAACAGGGTATGA-3'	209
	R	5'-CAGAGACAGCCAGGAGAA-3'

Group	ALP [λ_B/(U·L^－1)]	OC [ρ_B/(μg·L^－1)]	OPG [ρ_B/(μg·L^－1)]	PINP [ρ_B/(μg·L ^－1)]	TRACP [λ_B/(U·L^－1)]	RANKL [ρ_B/(μg·L^－1)]	OPG/RANKL
Control	88.865±2.895	1.179±0.177	8.657±1.239	12.290±0.801	15.236±0.960	1.552±0.191	5.663±1.273
Model	127.161±8.473^*	4.909±0.643^*	14.093±1.329^*	19.803±1.554^*	31.363±2.441^*	3.488±0.494^*	4.133±0.899
Estradiol	90.680±12.223^△	2.919±0.253^△	9.916±1.080^△	12.610±1.724^△	17.828±1.683^△	1.730±0.580^△	6.005±2.044
Estradiol combined with 1,25(OH)₂D₃	96.316±13.252^△	4.157±0.216^＃	14.526±1.610^＃	11.372±1.769^△	8.063±2.054^△＃	0.819±0.184^△＃	18.226±3.414^△＃

Group	BMD (mg·cm^－2)	Elastic modulus (P/Mpa)	Stiffness (N·mm^－1)	Maximum stress (N·mm^－2)	Maximum lord (F/N)
Control	123.645±10.167	635.809±64.746	872.072±38.823	21.131±1.535	103.778±4.979
Model	67.092±5.110^*	337.594±60.210^*	612.921±106.258^*	9.138±1.723^*	48.453±7.721^*
Estradiol	97.870±5.557^△	493.003±65.654^△	813.682±22.937^△	15.624±3.054^△	96.192±4.170^△
Estradiol combined with 1,25(OH)₂D₃	132.234±11.911^△＃	670.116±87.066^△＃	856.421±42.933^△	20.524±1.707^△＃	99.825±8.595^△

Group	ALP	OC	OPG	RANKL
Control	1	1	1	1
Model	1.551±0.173^*	2.806±0.647^*	3.148±0.061^*	2.598±0.407^*
Estradiol	1.041±0.102^△	1.543±0.371^△	1.340±0.307^△	1.085±0.160^△
Estradiol combined with 1,25(OH)₂D₃	1.060±0.279^△	1.622±0.615^△	3.479±0.618^＃	0.390±0.223^△＃

[1]	李希宁, 翁伟, 沈哲源, 豆晓杰, 赵宇, 闵继康. mTOR磷酸化水平对成骨MC3T3E1细胞增殖、自噬和分化的作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 575-586.
[2]	吴玉洁, 邢学农. NIPA2通过JAK/STAT信号通路对高糖诱导的成骨细胞凋亡的调控作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(02): 280-285.
[3]	杨丽娟, 夏雪怡, 王振江, 吴殿秀, 葛贺, 张莹, 林珈羽, 赵鹏, 荆琦, 张瀚元, 刘艳波. 17β-雌二醇对失血性休克家兔肠系膜微循环的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(06): 1199-1205.
[4]	冷冰, 王大麟, 郑淑云, 韩梅, 吴震宇, 裴颖, 薛昊罡. 17β-雌二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Ca²⁺通道的作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(05): 1041-1045.
[5]	刘宇妍, 于文雯, 申玉芹, 秦甜甜, 周雪纯, 黄蕾, 孙新华. 聚乙烯亚胺衍生物PEN介导寡核苷酸MT01递送对实验性大鼠牙移动的抑制作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(04): 790-795.
[6]	刘静乔, 郑燕, 王玉静, 孟亚丽, 徐淑稳, 张华林. 戊酸雌二醇联合阿司匹林对大鼠宫腔黏连的改善作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(04): 830-835.
[7]	孟阳, 杨明锡, 王柳然, 刘东宁, 于维先, 王闻天, 武洲. 葡萄糖酸锌碳点在细胞成像和体外促进成骨分化中的作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(03): 504-510.
[8]	李希宁, 陈晓春, 朱云飞, 曹泾楠, 邹忆婷, 杜霄, 王旗春. PERK信号通路对实验性绝经后骨质疏松雌性大鼠成骨细胞分化的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(02): 260-264.
[9]	成洪聚, 亚白柳, 辛青, 刘文彦. 骨组织中阿片肽系统的研究进展[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(06): 1291-1294.
[10]	赵欢, 史册, 张雪, 李媛, 刘杰, 李杏, 胡月, 孙宏晨. 激活素受体样激酶2调控骨重塑的研究进展[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(06): 1278-1281.
[11]	郭莉, 张晓霞, 于美玲, 赵婷, 张利群. 羟乙基淀粉溶液对卵巢过度刺激综合征的预防作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1147-1150.
[12]	齐佳, 孙新华, 黄粲, 娄译心, 汪洋, 申玉芹. 新型多级孔生物玻璃对人成骨细胞增殖和分化的促进作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1049-1053.
[13]	刘引, 申玉芹, 高涵, 费鸿博, 胡天琦, 李洋洋, 顾中一, 林崇韬. MT01对牙龈卟啉单胞菌感染成骨细胞MG63中Ⅰ型胶原mRNA表达的促进作用及其意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 681-684.
[14]	韩立赤, 王雪红, 董会, 汪义菲, 张福胤, 向彬. 苯肾上腺素对大鼠成骨细胞放射损伤的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2015, 41(06): 1113-1117.
[15]	冷冰, 马恩元, 何巍, 蒋为海, 辛建海, 薛昊罡. 17β-雌二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2015, 41(04): 763-768.