mTOR磷酸化水平对成骨MC3T3E1细胞增殖、自噬和分化的作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20210306

摘要/Abstract

摘要： 目的

通过雷帕霉素（RAPA）和MHY1485抑制和激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化，探讨磷酸化mTOR（p-mTOR）水平变化对成骨细胞增殖、自噬和分化的作用及其机制。

方法

小鼠成骨MC3T3-E1细胞分为对照组、20 nmol·L^－1 RAPA组、60 nmol·L^－1RAPA组、160 nmol·L^－1 RAPA 组和2.0 μmol·L^－1 MHY1485组。流式细胞术检测各组不同细胞周期MC3T3-E1细胞百分率，Western blotting和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中mTOR及下游真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体S6激酶1（S6K1）、B淋巴细胞瘤 2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和Caspase-3、碱性磷酸酶（ALP）、Runt 相关转录因子2（Runx2）和成骨相关转录因子Osterix的表达水平，茜素红染色观察各组成骨MC3T3-E1细胞矿化能力。

结果

与对照组比较，20和60 nmol·L^－1RAPA组细胞增殖活性升高（P<0.05或P<0.01），G₁期细胞百分率降低（P<0.05或P<0.01），S期细胞百分率升高（P<0.05或P<0.01），细胞中p-mTOR及其下游通路磷酸化4E-BP1（p-4E-BP1）、磷酸化S6K1（p-S6K1）水平和p62、Bax、Cleaved-Caspase-3表达水平降低（P<0.05或P<0.01）、LC3-Ⅱ、Bcl-2、ALP和Runx2表达水平升高（P<0.05或P<0.01）；与对照组比较，160 nmol·L^－1 RAPA组细胞增殖活性降低（P<0.01）、细胞中p-mTOR、p-4E-BP1和p-S6K1水平明显降低（P<0.05或P<0.01），2.0 μmol·L^－1 MHY1485组细胞增殖活性明显降低（P<0.01），细胞中p-mTOR、p-4E-BP1和p-S6K1水平明显升高（P<0.01），160 nmol·L^－1 RAPA和2 μmol·L^－1 MHY1485组细胞中Bax和Cleaved-Caspase-3表达水平升高（P<0.05或P<0.01），Bcl-2、ALP、Runx2和Osterix表达水平降低（P<0.05或P<0.01）；作用12 d后，20和60 nmol·L^－1RAPA组细胞中可见明显矿化结节，160 nmol·L^－1 RAPA和2.0 μmol·L^－1 MHY1485组成骨细胞中见极少数钙盐结晶。

结论

轻中度抑制mTOR的磷酸化可促进成骨细胞增殖、自噬和分化，而过度抑制和增强mTOR磷酸化则具有相反作用。

关键词: 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白, 成骨细胞, 细胞增殖, 自噬, 分化

Abstract: Objective

To inhibit and activate the phosphorylation of mammalian target protein of rapamycin （mTOR） by rapamycin （RAPA） and MHY1485，and to discuss the effect of level of phosphorylated mTOR（p-mTOR） on the proliferation， autophagy and differentiation of osteoblasts and its mechanism.

Methods

The mouse MC3T3-E1 osteoblasts were divided into control group， 20 nmol·L^－1 RAPA group， 60 nmol·L^－1 RAPA group， 160 nmol·L^－1 RAPA group and 2.0 μmol·L^－1 MHY1485 group. The percentages MC3T3E1 osteoblasts at different cell cycles in various groups were detected by flow cytometry；the expression levels of mTOR and downstream signals—IF4E-binding protein 1 （4E-BP1） and ribosome protein subunit 6 kinase 1 （S6K1），B cell lymphoma-2（Bcl-2），Bcl-2 related X protein（Bax），and Caspase-3，alkaline phosphatase （ALP）， Runt-related transcription factor 2 （Runx2），and osteoblast-related transcription factor Osterix were detected by Western blotting and Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） methods；the mineralization ability of MC3T3-E1 osteoblasts in various groups was observed by Alizarin red staining.

Results

Compared with control group， the proliferation activities of MC3T3-E1 osteoblasts in 20 and 60 nmol·L^－1RAPA groups were significantly increased（P<0.05 or P<0.01）， the percentages of MC3T3-E1 osteoblasts at G₁ phase were increased（P<0.05 or P<0.01），the percentages of the MCET3-E1 osteoblasts at S phase were increased（P<0.05 or P<0.01），the expression levels of p-mTOR and its downstream pathway of p-4E-BP1 and p-S6K1， as well as p62，Bax，and Cleaved-Caspase-3 were decreased（P<0.05 or P<0.01），and the expression levels of LC3-Ⅱ， Bcl-2， ALP and Runx2 were increased （P<0.05 or P<0.01）.Compared with control group，the proliferation activity of MC3T3-E1 osteoblasts in 160 nmol·L^－1 RAPA group was significantly decreased（P<0.01），and the expression levels of p-mTOR，p-4E-BP1， and p-S6K1 were decreased （P<0.05 or P<0.01）；the proliferation activity of MC3T3-E1 osteoblasts in 2.0 μmol·L^－1 MHY1485 group was decreased（P<0.01），and the expression levels of p-mTOR，p-4E-BP1， and p-S6K1 were decreased（P<0.01）；however，the expression levels of Bax and Cleaved-Caspase-3 in both 160 nmol·L^－1 RAPA and 2.0 μmol·L^－1 MHY1485 groups were increased（P<0.05 or P<0.01），and the expression levels of Bcl-2， ALP， Runx2， and Osterix were decreased（P<0.05 or P<0.01）.Twelve days after treatment， the mineralized nodules were found in the MC3T3-E1 osteoblasts in 20 and 60 nmol·L^－1RAPA groups， and only a very small amount of calcium salt were found in the MC3T3-E1 osteoblasts in 160 nmol·L^－1 RAPA and 2.0 μmol·L^－1 MHY1485 groups.

Conclusion

Mild to moderate inhibition of mTOR phosphorylation can promote the proliferation， autophagy and differentiation of the MC3T3-E1 osteoblasts，while excessive inhibition and enhancement of mTOR phosphorylation have the opposite effect.

Key words: mammalian target of rapamycin, osteoblasts, cell proliferation, autophagy, cell differentiation

中图分类号:

R329.28

李希宁, 翁伟, 沈哲源, 豆晓杰, 赵宇, 闵继康. mTOR磷酸化水平对成骨MC3T3E1细胞增殖、自噬和分化的作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 575-586.

Xining LI, Wei WENG, Zheyuan SHEN, Xiaojie DOU, Yu ZHAO, Jikang MIN. Effect of mTOR phosphorylation level on proliferation,autophagy，and differentiation of MC3T3-E1 osteoblasts and its mechanism[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2021, 47(3): 575-586.

图/表 14

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参考文献

1	DIAB D L， WATTS N B. Postmenopausal osteoporosis［J］.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes， 2013， 20（6）： 501-509.
2	LAVOIE B， LIAN J B， MAWE G M. Regulation of bone metabolism by serotonin［J］. Adv Exp Med Biol， 2017， 1033： 35-46.
3	DRAKE M T， CLARKE B L， LEWIECKI E M. The pathophysiology and treatment of osteoporosis［J］. Clin Ther， 2015， 37（8）： 1837-1850.
4	GUI X， CHEN H， CAI H， et al. Leptin promotes pulmonary fibrosis development by inhibiting autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2018， 498（3）： 660-666.
5	YURUBE T， ITO M， KAKIUCHI Y， et al. Autophagy and mTOR signaling during intervertebral disc aging and degeneration［J］.JOR Spine，2020，3（1）：e1082.
6	HE H， ZENG Q， HUANG G， et al. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation exerts neuroprotective effects following cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting autophagy via the PI3K/Akt pathway［J］. Brain Res， 2019， 1707： 124-132.
7	ZHAO J， WU J， XU B， et al. Kaempferol promotes bone formation in part via the mTOR signaling pathway［J］. Mol Med Rep， 2019， 20（6）： 5197-5207.
8	LIANG G， LIU M， WANG Q， et al. Itraconazole exerts its anti-melanoma effect by suppressing Hedgehog， Wnt， and PI3K/mTOR signaling pathways［J］. Oncotarget， 2017， 8（17）： 28510-28525.
9	KARNER C M， LEE S Y， LONG F X. Bmp induces osteoblast differentiation through both Smad4 and mTORC1 signaling［J］. Mol Cell Biol， 2017， 37（4）. DOI：10.1128/mcb.00253-16.
10	ETNYRE D， STONE A L， FONG J T， et al. Targeting c-Met in melanoma： mechanism of resistance and efficacy of novel combinatorial inhibitor therapy［J］. Cancer Biol Ther， 2014， 15（9）： 1129-1141.
11	NIKONOROVA I A， AL-BAGHDADI R J T， MIREK E T， et al. Obesity challenges the hepatoprotective function of the integrated stress response to asparaginase exposure in mice［J］. J Biol Chem， 2017， 292（16）： 6786-6798.
12	TOMLINSON I. The Mendelian colorectal cancer syndromes［J］. Ann Clin Biochem， 2015， 52（pt 6）： 690-692.
13	ZHAO H L， YANG L Q， CUI H J. SIRT1 regulates autophagy and diploidization in parthenogenetic haploid embryonic stem cells［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2015， 464（4）： 1163-1170.
14	ZHAO D， YANG J， YANG L. Insights for oxidative stress and mTOR signaling in myocardial ischemia/reperfusion injury under diabetes［J］. Oxid Med Cell Longev， 2017， 2017： 6437467.
15	PERUMAL E， PAUL V， GOVINDARAJAN V，et al. A brief review on experimental fluorosis［J］. Toxicol Lett， 2013， 223（2）： 236-251.
16	WANG Y， ZHANG H. Regulation of autophagy by mTOR signaling pathway［J］. Adv Exp Med Biol， 2019， 1206： 67-83.
17	KIM J， KUNDU M， VIOLLET B， et al. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1［J］.Nat Cell Biol，2011，13（2）：132-141.
18	D’ARCY M S. Cell death： a review of the major forms of apoptosis， necrosis and autophagy［J］. Cell Biol Int， 2019， 43（6）： 582-592.
19	XIA Y， LIU J. An overview on chronic arsenism via drinking water in PR China［J］. Toxicology， 2004， 198（1/3）： 25-29.
20	GUPTA N， GUPTA N， CHHABRA P. Image diagnosis： dental and skeletal fluorosis［J］. Perm J， 2016， 20（1）： e105-e106.
21	APARICIO I M， MARTIN MU?OZ P， SALIDO G M， et al. The autophagy-related protein LC3 is processed in stallion spermatozoa during short-and long-term storage and the related stressful conditions［J］. Animal， 2016， 10（7）： 1182-1191.
22	GóMEZ-SáNCHEZ R， YAKHINE-DIOP S M， RODRíGUEZ-ARRIBAS M， et al. mRNA and protein dataset of autophagy markers （LC3 and p62） in several cell lines［J］. Data Brief， 2016， 7： 641-647.
23	YIN X， ZHOU C， LI J， et al. Autophagy in bone homeostasis and the onset of osteoporosis［J］. Bone Res， 2019， 7： 28.
24	FANG F， WEI X， HU M， et al. A mouse model of craniofacial bone lesion of tuberous sclerosis complex［J］. Musculoskelet Regen， 2015， 1（1）：e814.
25	YANG H， WEN Y， ZHANG M， et al. MTORC1 coordinates the autophagy and apoptosis signaling in articular chondrocytes in osteoarthritic temporomandibular joint［J］. Autophagy， 2020， 16（2）： 271-288.

Primer	Primer sequence	Length of product （bp）
p62	Forward 5'-GTGTGCCCAGACTACGACCT-3'	242
	Reverse 5'-GACTCAGCTGTAGGGCAAGG-3'
LC3	Forward 5'-CCGACCGCTGTAAGGAGG-3'	322
	Reverse 5'-AAGCCGAAGGTTTCTTGGGA-3'
Bcl-2	Forward 5'-CGGGAGAACAGGGTATGA-3'	210
	Reverse 5'-CAGAGACAGCCAGGAGAA-3'
Bax	Forward 5'-AGGGTTTCATTCCAGGATCGAGC-3'	195
	Reverse 5'-AGGCGGTGAGGACTCCAGCC-3'
Caspase-3	Forward 5'-ATGGACAACAACGAAACCTCCGTG-3'	306
	Reverse 5'-CCACTCCCAGTCATTCCTTTAGTG-3'
ALP	Forward 5'-TGCCCTGAAACTCCAAAAGC-3'	250
	Reverse 5'-CTTCACGCCACACAAGTAGG-3'
Osterix	Forward 5'-CATCCCTATGGCTCGTGGTA-3'	225
	Reverse 5'-TGGGTTAAGGGGAGCAAAGT-3'
Runx2	Forward 5'-CCCAGCCACCTTTACCTACA-3'	150
	Reverse 5'-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3'
GAPDH	Forward 5'-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3'	229

[1]	母润红, 刘馨竹, 林睿, 李雨澎, 王璐瑶, 王春雨, 郭笑. PRDX6过表达对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其分子机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 559-565.
[2]	刘翠兰, 李建军, 姜贺, 刘晶, 王丹, 李晨, 赵娣. 尿石素B对人神经胶质瘤U118 MG细胞生物学行为的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 566-574.
[3]	冯佳, 徐海婵, 温健, 吴泽华, 陈琦. 桦木酸通过调控JAK2/STAT3信号通路对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 615-622.
[4]	李晓辉, 瞿紫微, 卢昕, 孟庆彬, 陈华涛, 任骏, 谭成沛. 骨髓间充质干细胞来源性外泌体携带miR-196b-5p对结肠癌细胞生物学特性的调控作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 660-668.
[5]	杨颖, 赵伟, 吕丹. C19ORF12对胃癌MKN45细胞增殖和化疗药敏感性的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 687-693.
[6]	吴越, 杨帅, 周晶晶, 李真胜男, 孟宪瑛, 臧晓军. 甲状腺交界性肿瘤诊断和预后相关分子标志物的研究进展Research progress in diagnosis- and prognosis-related molecular markers of borderline thyroid tumor[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 802-810.
[7]	张淑荣,张琦颖. 木犀草素通过TLR4/MyD88信号通路对大鼠烟曲霉菌性角膜炎的调控作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(2): 315-322.
[8]	唐浩轩,孟楠峰,杜美玲,王伟,何涛. 新型VEGF单克隆抗体与全反式维甲酸联合应用对乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(2): 344-351.
[9]	张春英,阴广维,尤鸣达,陈红,胡耀杰,李岩冰,陈春悠. siRNA 靶向沉默TAK1基因对甲状腺癌细胞增殖、迁移和p38 MAPK信号通路的抑制作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(1): 110-117.
[10]	裴永彬,王桂琦,李卫,姜霞,姜海波,赵增仁. 姜黄素对结直肠癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其PTEN/PI3K/Akt信号通路机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(1): 145-151.
[11]	吕美娟,马贤德,任路. 针药并用诱导自噬对ApoE基因敲除小鼠认知功能的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(6): 1124-1130.
[12]	杨吉平, 费琳, 柴学军, 苟兴春. MyD88抑制肽对LPS诱导BV2小胶质细胞极化状态的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 899-904.
[13]	郭玮玮, 秦悦, 杨海波, 米占虎. LncRNA MALAT1通过miR-34c/SATB2轴对脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 963-971.
[14]	曾瑞霞, 张轶博. p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞成脂的促进作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 979-984.
[15]	魏旭静, 李林, 张红真, 王景, 徐静. LncRNA CCAT1通过TGF-β/Smad信号通路对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 1016-1022.