lncRNA GPRC5D-AS1对地塞米松诱导小鼠成肌细胞肌萎缩的抵抗和再生作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20230608

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨长链非编码RNA（lncRNA）GPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠成肌细胞肌萎缩的抵抗和再生作用，并阐明其作用机制。方法选取对数生长期C2C12细胞，检测0、25、50、75、 100、 200和400 mg·L^－1地塞米松诱导24、48和72 h后C2C12细胞存活率，筛选肌萎缩模型诱导的最佳作用剂量和时间。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测C2C12细胞中lncRNA GPRC5D-AS1表达水平以验证细胞模型。将C2C12细胞分为正常组、模型组、lncRNA GRPC5D-AS1-NC组和lncRNA GRPC5D-AS1-OE组，RT-qPCR法检测各组细胞中lncRNA GPRC5D-AS1表达水平，流式细胞术检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组细胞中谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）、铁离子（Fe²⁺）和丙二醛（MDA）水平，透射电镜观察各组细胞线粒体超微结构表现，免疫荧光法检测各组细胞中成肌分化蛋白（MyoD）表达情况，Western blotting法检测各组细胞中铁死亡相关蛋白表达水平。结果 100 mg·L^－1地塞米松诱导48 h时造模效果最佳。与正常C2C12细胞比较，100 mg·L^－1地塞米松诱导48 h后C2C12细胞中lncRNA GPRC5D-AS1表达水平降低（P<0.05），证实lncRNA GPRC5D-AS1在肌萎缩模型中有调控作用。RT-qPCR法检测，与正常组比较，模型组细胞中lncRNA GRPC5D-AS1表达水平降低（P<0.05）；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中lncRNA GRPC5D-AS1表达水平升高（P<0.05）。流式细胞术检测，与正常组比较，模型组细胞中ROS水平升高（P<0.05）；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较， lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中ROS水平降低（P<0.05）。ELISA法检测，与正常组比较，模型组细胞中Fe²⁺和MDA水平升高（P<0.05），GPX4水平降低（P<0.05）；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中Fe²⁺和MDA水平降低（P<0.05），GPX4水平升高（P<0.05）。透射电镜观察，正常组细胞外形圆整，大小正常，膜上绒毛丰富，线粒体细胞器形态正常；模型组细胞中线粒体数量减少，胞浆颗粒化，线粒体结构模糊肿胀并出现典型铁死亡相关现象；lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中线粒体数增加，胞浆颗粒化现象减少，线粒体结构较清晰。免疫荧光法检测，与正常组比较，模型组细胞中MyoD表达减少，细胞发生肌萎缩；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中MyoD表达明显增加，细胞肌萎缩现象缓解，成肌细胞再生较多。Western blotting法检测，与正常组比较，模型组细胞中长链脂酰辅酶A合成酶（ACSL）4蛋白表达水平升高（P<0.05），溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和GPX4蛋白表达水平降低（P<0.05）；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中ACSL4蛋白表达水平降低（P<0.05），SLC7A11和GPX4蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论 lncRNA GPRC5D-AS1地塞米松诱导的成肌细胞铁死亡起到保护作用，可促进细胞修复再生，其作用机制与调控SLC7A11/GPX4/ACSL4信号通路有关。

关键词: 肌萎缩, 长链非编码RNA GPRC5D-AS1, 铁死亡, 地塞米松, 成肌细胞

Abstract:

Objective To discuss the resistance and regeneration effects of long non-coding RNA （lncRNA） GPRC5D-AS1 on the muscle atrophy of myocytes in the mice induced by dexamethasone， and to clarify its mechanism. Methods The C2C12 cells at logarithmic growth phase were selected. The survival rates of the cells after treated with 0， 25， 50， 75， 100， 200 and 400 mg·L^－1 dexamethasone for 24， 48 and 72 h were detected， which was used to select the optimal dose and time to induce the muscle atrophy model.The expression level of lncRNA GPRC5D-AS1 in the C2C12 cells was detected by real-time fluroscence quantitative PCR（RT-qPCR） method to validate the cell model. The C2C12 cells were divided into normal group， control group，lncRNA GPRC5D-AS1-NC group，and lncRNA GPRC5D-AS1-OE group. The expression levels of lncRNA GPRC5D-AS1 in the cells in various groups were detected by RT-qPCR method. The levels of reactive oxygen species （ROS）， glutathione peroxidase 4 （GPX4）， ferrous ion （Fe²⁺） and malondialdehyde （MDA） in the cells in various groups were detected by flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method； the ultrastructural changes of mitochondria in the cells in various groups were observed under transmission electron microscope； the expression of myogenic differentiation protein （MyoD） in the cells in various groups was detected by immunofluorescence； the expression levels of ferroptosis-related proteins in the cells in various groups were detected by Western blotting method. Results The best modeling effect was achieved with 100 mg·L^－1 dexamethasone at 48 h. Compared with normal C2C12 cells， the expression level of lncRNA GPRC5D-AS1 in the C2C12 cells after treated with 100 mg·L^－1 dexamethasone for 48 h was decreased （P<0.05）， confirming that lncRNA GPRC5D-AS1 had a regulatory role in the muscle atrophy model. The RT-qPCR results showed that compared with normal group， the expression level of lncRNA GRPC5D-AS1 in the cells in model group was decreased （P<0.05）； compared with model group and lncRNA GRPC5D-AS1-NC group， the expression level of lncRNA GRPC5D-AS1 in the cells in lncRNA GRPC5D-AS1-OE group was increased （P<0.05）. The flow cytometry results showd that compared with normal group， the ROS level in the cells in model group was increased （P<0.05）； compared with model group and lncRNA GRPC5D-AS1-NC group， the ROS level in the cells in lncRNA GRPC5D-AS1-OE group was decreased （P<0.05）. The ELISA results showed that compared with normal group， the levels of Fe²⁺ and MDA in the cells in model group were increased （P<0.05）， and the level of GPX4 was decreased （P<0.05）； compared with model group and lncRNA GRPC5D-AS1-NC group， the levels of Fe²⁺ and MDA in the cells in lncRNA GRPC5D-AS1-OE group were decreased （P<0.05）， and the level of GPX4 was increased （P<0.05）. The transmission electron microscope results showed that the cells in normal group were round and normal in size with rich cilia on the membrane， and the mitochondria had a normal morphology； the cells in model group had less mitochondria and granulation in the cytoplasm， with blurred and swollen mitochondrial structures and typical ferroptosis-related manifestations； the number of mitochondria in the cells in lncRNA GRPC5D-AS1-OE group was increased，and the granulation in cytoplasm of the cells was decreased， and showed clearer mitochondrial structures. The immunofluorescence detection results showed that compared with normal group，the expression of MyoD in the cells in model group was decreased and the cells exhibited muscle atrophy； compared with model group and lncRNA GRPC5D-AS1-NC group， the expression of MyoD in the cells in lncRNA GRPC5D-AS1-OE group was increased， and the cells exhibited less muscle atrophy and more regeneration of myocytes. The Western blotting results revealed that compared with the normal group， the expression level of long-chain acyl-coenzyme A synthase （ACSL）4 protein in the cell in model group was increased （P<0.05）， and the expression levels of solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11） and GPX4 proteins were decreased （P<0.05）； compared with model group and lncRNA GRPC5D-AS1-NC group， the expression level of ACSL4 protein in the cells in lncRNA GRPC5D-AS1-OE group was decreased （P<0.05）， and the expression levels of SLC7A11 and GPX4 proteins were increased （P<0.05）. Conclusion LncRNA GPRC5D-AS1 can protect the ferroptosis in the myocytes induced by dexamethasone and promote the repairment and regeneration of the cells，and its mechanism is related to regulating the SLC7A11/GPX4/ACSL4 signaling pathway.

Key words: Muscular dystrophy, Long non-coding RNA, GPRC5D-AS1, Ferroptosis, Dexamethasone, Myocytes

中图分类号:

R685

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图/表 9

表1

表2

不同剂量地塞米松作用后C2C12细胞存活率 (n=5)"

Group	A value	Survival rate(η/%)
Dexamethosone[ρ_B/(mg·L^－1)]
0	1.000 $±$ 0.049	100.0
25	0.807 $±$ 0.013	80.7
50	0.771 $±$ 0.021	77.1
75	0.731 $±$ 0.018	73.1
100	0.623 $±$ 0.039	62.3
200	0.219 $±$ 0.023	21.9
400	0.136 $±$ 0.031	13.6

表2

表3

作用不同时间后C2C12细胞存活率 (n=5)"

Group	A value	Survival rate(η/%)
Induction time(t/h)
0	1.000 $±$ 0.071	100.0
24	0.742 $±$ 0.018	74.2
48	0.637 $±$ 0.042	63.7
72	0.281 $±$ 0.064	28.1

表3

图 1

图2

表4

各组细胞中GPX4、Fe2+和MDA水平"

Group	GPX4	Fe²⁺	MDA
Normal	303.749 $±$ 27.244	0.572 $±$ 0.006	21.057 $±$ 0.829
Model	158.745 $±$ 11.129^*	0.837 $±$ 0.034^*	37.135 $±$ 0.749^*
LncRNA GPRC5D-AS1-NC	147.371 $±$ 22.815	0.863 $±$ 0.029	36.493 $±$ 0.681
LncRNA GPRC5D-AS1-OE	233.042 $±$ 34.649^△#	0.748 $±$ 0.019^△#	26.565 $±$ 1.124^△#

表4

图 3

图 4

图 5

参考文献 30

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Gene	Primer sequence
GAPDH	F：5'-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3'
GAPDH	R：5'-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3'
lncRNA GRPC5D- AS1	F：5'-TGGGACAGAACTGGAGTCAGA-3'
lncRNA GRPC5D- AS1	R：5'-CCAGCCTGGTTGAATGAAACG-3'

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