牙龈卟啉单胞菌脂多糖对巨噬细胞中铁死亡相关因子表达水平的影响

doi:10.13481/j.1671-587X.20220507

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P.g-LPS）对巨噬细胞中铁死亡相关因子表达水平的影响，阐明铁死亡相关因子在牙周炎发病机制中的作用。方法培养小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞，分为实验组和对照组，实验组加入10 mg·L^－1P.g-LPS 分别处理6 、12 和24 h，对照组不做任何处理。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测2组RAW264.7细胞中长链酯酰辅酶A合成酶4（ACSL4）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和转铁蛋白受体1（TfR1）mRNA表达水平，2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法检测2组RAW264.7细胞中活性氧（ROS）水平，硫代巴比妥酸（TBA）法检测2组RAW264.7细胞中丙二醛（MDA）水平，亚铁离子荧光探针（FeRhonox-1）法检测2组RAW264.7细胞中亚铁离子（Fe²⁺）水平，Western blotting法检测2组RAW264.7细胞中ACSL4、GPX4和TfR1蛋白表达水平。结果与对照组比较，处理6、12和24 h后，实验组RAW264.7细胞中GPX4 mRNA表达水平降低（P<0.05），处理12和24 h后ACSL4和TfR1 mRNA表达水平升高（P<0.05）；处理12和24 h后，实验组RAW264.7细胞中ACSL4和TfR1蛋白表达水平升高（P<0.05），GPX4蛋白表达水平降低（P<0.05）。与对照组比较，实验组RAW264.7细胞中ROS、MDA和Fe²⁺水平升高（P<0.05），且随时间增加呈上升趋势。结论 P.g-LPS诱导下RAW264.7细胞中铁死亡相关因子ACSL4和TfR1表达水平升高，而GPX4表达水平降低，并且呈时间依赖性，提示上述铁死亡相关因子的变化可能与牙周炎发病机制有关。

关键词: 巨噬细胞, 牙龈卟啉单胞菌, 脂多糖, 铁死亡, 活性氧

Abstract:

Objective To investigate the effect of lipopolysaccharide （LPS） of Porphyromonas gingivalis （P.g） on the expression levels of ferroptosis-related factors in the macrophages， and to clarify the influence of ferroptosis-related factors in the pathogenesis of periodontitis. Methods The mouse mononuclear/macrophage line RAW264.7 cells were cultured and divided into experimental group and control group. The cells in experimental group were treated with 10 mg·L^－1P.g-LPS for 6， 12， and 24 h， respectively； the cells in control group were not treated. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was performed to detect the expression levels of long chain acyl-CoA synthetase 4 （ACSL4）， glutathione peroxidase 4 （GPX4）， and transferrin receptor 1 （TfR1） mRNA in the RAW264.7 cells in two groups. The levels of reactive oxygen species （ROS） in the RAW264.7 cells in two groups were detected by 2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH-DA） fluorescence probe method. The levels of malondialdehyde （MDA） in the RAW264.7 cells in two groups were detected by thiobarbituric acid （TBA） method and the levels of ferrous ion （Fe²⁺） in the RAW264.7 cells in two groups were detected by Ferrousion fluorescent probe （FeRhonox-1） method. The expression levels of ACSL4， GPX4， and TfR1 proteins in the RAW264.7 cells in two groups were detected by Western blotting method. Results Compared with control group， the expression levels of GPX4 mRNA in the RAW264.7 cells in experimental group after treated for 6， 12， and 24 h were decreased （P<0.05）， the expression levels of ACSL4 and TfR1 mRNA in the RAW264.7 cells in experimental group after treated for 12 and 24 h were increased （P<0.05）； the expression levels of ACSL4 and TfR1 proteins in the RAW264.7 cells in experimental group after treated for 12 and 24 h were increased （P<0.05）；the expression levels of GPX4 protein in the RAW264.7 cells in experimental group after treated for 12 and 24 h were decreased （P<0.05）.Compared with control group，the levels of ROS， MDA， and Fe²⁺in the RAW264.7 cells in experimental group were significantly increased （P<0.05）， and showed an increasing trend with time prolongation. Conclusion The expression levels of ferroptosis-related factors ACSL4 and TfR1 are increased and the expression level of GPX4 is decreased in a time-dependent manner induced by P.g-LPS， suggesting that the changes of ferroptosis-related factors may be related to the pathogenesis of periodontitis.

Key words: Macrophages, Porphyromonas gingivalis, Lipopolysaccharide, Ferroptosis, Reactive oxygen species

中图分类号:

R781.42

杜雪纯,李保胜,乔树伟,欧燕珍,李珍,孟维艳. 牙龈卟啉单胞菌脂多糖对巨噬细胞中铁死亡相关因子表达水平的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(5): 1148-1155.

Xuechun DU,Baosheng LI,Shuwei QIAO,Yanzhen OU,Zhen LI,Weiyan MENG. Effect of Porphyromonas gingivalis-LPS on expression levels of ferroptosis-related factors in macrophages[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2022, 48(5): 1148-1155.

图/表 6

表1

图1

图2

表2

图3

图4

参考文献 38

1	JIAO J， JING W D， SI Y， et al. The prevalence and severity of periodontal disease in Mainland China： data from the Fourth National Oral Health Survey （2015-2016）［J］. J Clin Periodontol， 2021， 48（2）： 168-179.
2	SLOTS J. Periodontitis： facts， fallacies and the future［J］. Periodontol 2000， 2017， 75（1）： 7-23.
3	XU W Z， ZHOU W， WANG H Z， et al. Roles of porphyromonas gingivalis and its virulence factors in periodontitis［J］. Adv Protein Chem Struct Biol， 2020， 120： 45-84.
4	ORECCHIONI M， GHOSHEH Y， PRAMOD A B，et al.Macrophage polarization： different gene signatures in M1（LPS+） vs. classically and M2（LPS－） vs. alternatively activated macrophages［J］. Front Immunol， 2019， 10： 1084.
5	HIRSCHHORN T， STOCKWELL B R. The development of the concept of ferroptosis［J］. Free Radic Biol Med， 2019， 133： 130-143.
6	XU T， DING W， JI X Y， et al. Molecular mechanisms of ferroptosis and its role in cancer therapy［J］. J Cell Mol Med， 2019， 23（8）： 4900-4912.
7	LI J C， LU K M， SUN F L， et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway［J］. J Transl Med， 2021， 19： 96.
8	WEI S S， BI J B， YANG L F， et al. Serum irisin levels are decreased in patients with sepsis， and exogenous irisin suppresses ferroptosis in the liver of septic mice［J］. Clin Transl Med， 2020， 10（5）： e173.
9	ZHAO Y H， LI J， GUO W， et al. Periodontitis-level butyrate-induced ferroptosis in periodontal ligament fibroblasts by activation of ferritinophagy［J］. Cell Death Discov， 2020， 6（1）： 119.
10	GUO W， ZHAO Y H， LI H X， et al. NCOA4-mediated ferritinophagy promoted inflammatory responses in periodontitis［J］. J Periodontal Res， 2021， 56（3）： 523-534.
11	LI N， WANG W， ZHOU H， et al. Ferritinophagy-mediated ferroptosis is involved in sepsis-induced cardiac injury［J］. Free Radic Biol Med， 2020， 160： 303-318.
12	LIU P F， FENG Y T， LI H W， et al. Ferrostatin-1 alleviates lipopolysaccharide-induced acute lung injury via inhibiting ferroptosis［J］. Cell Mol Biol Lett， 2020， 25： 10.
13	PRESHAW P M， SEYMOUR R A， HEASMAN P A. Current concepts in periodontal pathogenesis［J］. Dent Update， 2004， 31（10）： 570-572， 574-578.
14	ALMUBARAK A， TANAGALA K K K， PAPAPANOU P N， et al. Disruption of monocyte and macrophage homeostasis in periodontitis［J］. Front Immunol， 2020， 11： 330.
15	MAO H M， ZHAO Y H， LI H X， et al. Ferroptosis as an emerging target in inflammatory diseases［J］. Prog Biophys Mol Biol， 2020， 155： 20-28.
16	MARTINET W， COORNAERT I， PUYLAERT P， et al. Macrophage death as a pharmacological target in atherosclerosis［J］. Front Pharmacol， 2019， 10： 306.
17	WANG Y， QUAN F， CAO Q H， et al. Quercetin alleviates acute kidney injury by inhibiting ferroptosis［J］. J Adv Res， 2020， 28： 231-243.
18	LI J， SHI J H， PAN Y， et al. Transcription modulation by CDK9 regulates inflammatory genes and RIPK3-MLKL-mediated necroptosis in periodontitis progression［J］. Sci Rep， 2019， 9（1）： 17369.
19	LUCAS H， BARTOLD P M， DHARMAPATNI A A S S K， et al. Inhibition of apoptosis in periodontitis［J］. J Dent Res， 2010， 89（1）： 29-33.
20	DIXON S J， LEMBERG K M， LAMPRECHT M R， et al. Ferroptosis： an iron-dependent form of nonapoptotic cell death［J］. Cell， 2012， 149（5）： 1060-1072.
21	TANG D L， KROEMER G. Ferroptosis［J］. Curr Biol， 2020， 30（21）： R1292-R1297.
22	ČEPELAK I， DODIG S， DODIG D Č. Ferroptosis： regulated cell death［J］. Arh Hig Rada Toksikol， 2020， 71（2）： 99-109.
23	YUAN H， LI X M， ZHANG X Y， et al. Identification of ACSL4 as a biomarker and contributor of ferroptosis［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2016， 478（3）： 1338-1343.
24	DOLL S， PRONETH B， TYURINA Y Y， et al. ACSL4 dictates ferroptosis sensitivity by shaping cellular lipid composition［J］. Nat Chem Biol， 2017， 13（1）： 91-98.
25	SEIBT T M， PRONETH B， CONRAD M. Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication［J］.Free Radic Biol Med，2019，133：144-152.
26	FENG H Z， SCHORPP K， JIN J， et al. Transferrin receptor is a specific ferroptosis marker［J］. Cell Rep， 2020， 30（10）： 3411-3423.e7.
27	PUDLA M， SRISATJALUK R， UTAISINCHAROEN P. Induction of inducible nitric oxide synthase （iNOS） in Porphyromonas gingivalis LPS-treated mouse macrophage cell line （RAW264.7） requires Toll-like receptor 9［J］. Inflamm Res， 2018， 67（9）： 723-726.
28	XIE Y， HOU W， SONG X， et al. Ferroptosis： process and function［J］.Cell Death Differ，2016，23（3）：369-379.
29	BAŇASOVÁ L， KAMODYOVÁ N， JANŠÁKOVÁ K， et al. Salivary DNA and markers of oxidative stress in patients with chronic periodontitis［J］. Clin Oral Investig， 2015， 19（2）： 201-207.
30	LI W Y， LI W， LENG Y， et al. Ferroptosis is involved in diabetes myocardial ischemia/reperfusion injury through endoplasmic reticulum stress［J］. DNA Cell Biol， 2020， 39（2）： 210-225.
31	STAMENKOVIC A， PIERCE G N， RAVANDI A. Phospholipid oxidation products in ferroptotic myocardial cell death［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2019， 317（1）： H156-H163.
32	GENG N， SHI B J， LI S L， et al. Knockdown of ferroportin accelerates erastin-induced ferroptosis in neuroblastoma cells［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci， 2018， 22（12）： 3826-3836.
33	VALKO M， LEIBFRITZ D， MONCOL J， et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2007， 39（1）： 44-84.
34	MYSAK J， PODZIMEK S， SOMMEROVA P， et al. Porphyromonas gingivalis： major periodontopathic pathogen overview［J］. J Immunol Res， 2014， 2014： 476068.
35	ROCHA D M， CALDAS A P， OLIVEIRA L L， et al. Saturated fatty acids trigger TLR4-mediated inflammatory response［J］. Atherosclerosis， 2016， 244： 211-215.
36	SONG M， JIN J J， LIM J E， et al. TLR4 mutation reduces microglial activation， increases Aβ deposits and exacerbates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease［J］. J Neuroinflammation， 2011， 8： 92.
37	NATIVEL B， COURET D， GIRAUD P， et al. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides act exclusively through TLR4 with a resilience between mouse and human［J］. Sci Rep， 2017， 7（1）： 15789.
38	WU C F， LIU C W， LUO K， et al. Changes in expression of the membrane receptors CD14， MHC-Ⅱ， SR-A， and TLR4 in tissue-specific monocytes/macrophages following Porphyromonas gingivalis-LPS stimulation［J］. Inflammation， 2018， 41（2）： 418-431.

Group	ACSL4	GPX4	TfR1
Control	1.00±0.13	1.00±0.03	1.00±0.04
Experimental
6 h	1.37±0.12	0.54±0.04^*	1.12±0.06
12 h	1.87±0.20^*△	0.37±0.02^*△	1.62±0.08^*△
24 h	2.31±0.12^*△#	0.30±0.02^*△#	1.96±0.18^*△#

Group	Level of MDA [m_B/(mmol·g^－1)]	Fluorescence intensity of Fe²⁺(AU)
Control	59.12±13.18	9.07±1.17
Experimental
6 h	308.60±31.33^*	19.08±1.80^*
12 h	462.20±50.31^*△	49.96±4.56^*△
24 h	697.50±30.16^*△#	68.34±4.61^*△#

[1]	沈鑫,刘洋,陈泓宇,张洁,程庆砾,杨光. 高糖通过miR-125b对小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的调控作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(4): 847-857.
[2]	乔树伟,李保胜,李效宇,王子璇,李碧榕,董博,孟维艳. 炎症状态下人牙周膜成纤维细胞中SLC7A11和GPX4的表达水平及其意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(4): 922-928.
[3]	李玮柏,曹娟,郭秀,林欣萍,董春玲,李波. 肿瘤相关巨噬细胞来源IL-6通过上调肿瘤细胞中LIF表达对口腔鳞状细胞癌Cal27细胞侵袭和迁移的促进作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(4): 946-953.
[4]	曲海新,袁二伟,郭卫平,张雅静,马文霞,吴丹. 木犀草素抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号通路激活对小鼠急性呼吸窘迫综合征的改善作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(3): 676-683.
[5]	李明,王秋婷,陈山,石慧芳. p38 MAPK抑制剂通过抑制NLRP3途径介导的细胞焦亡对小鼠慢性阻塞性肺疾病损伤的改善作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(3): 744-754.
[6]	刘依侬,张强,徐立. 阿托伐他汀对Ox-LDL/β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ诱导的血管内皮功能紊乱的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 317-323.
[7]	周阳,米旭光,蒲文星,汪文涛,景猛,孟繁凯. 褪黑素对过氧化氢诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化应激的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 340-347.
[8]	田野,阿不都米吉提·阿不都克力木null,王鹏,沙漠,崔崎. 肿瘤相关巨噬细胞极化状态对前列腺癌干细胞自我更新能力和血管生成拟态的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 374-382.
[9]	任飞龙,罗环宇,郑适泽,范心怡,任春霞,孟圆,赵红,史册,孙宏晨. C3a-C3aR轴通过巨噬细胞向M1型极化对慢性牙周炎模型小鼠炎症反应和组织损伤的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(1): 1-8.
[10]	刘昊川,李新贺,陈冰. 红细胞人源化小鼠模型的构建及其临床应用研究进展Research progress in construction and its clinical application of humanized mouse model of red blood cells[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(1): 241-248.
[11]	王瑞凤,刘旭旭,李芳,刘敏. 抗菌蓝光在治疗细菌感染性疾病中应用的研究进展Research progress in application of antimicrobial blue light in treatment of bacterial infectious diseases[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(1): 249-255.
[12]	毛丹,李志爽,程佳新,侯平. 参仙升脉口服液对病态窦房结综合征小鼠ROS表达的影响和对HCN4离子通道的调控作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(6): 1353-1361.
[13]	毛赫新,王琳源,关宁,高秀秋. 没食子酸对M1型巨噬细胞极化的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(5): 1139-1145.
[14]	李康宁,宋志领,贾利龙,楚妙,熊朝晖. 金银花提取物对LPS诱导的急性前部葡萄膜炎小鼠的抗炎作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(4): 978-983.
[15]	杨颖, 赵伟, 吕丹. C19ORF12对胃癌MKN45细胞增殖和化疗药敏感性的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 687-693.