重症肌无力患者外周血单个核细胞中线粒体自噬和凋亡相关基因表达及其诊断价值

doi:10.13481/j.1671-587X.20240222

吉林大学学报(医学版) ›› 2024, Vol. 50 ›› Issue (2): 481-488.doi: 10.13481/j.1671-587X.20240222

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重症肌无力患者外周血单个核细胞中线粒体自噬和凋亡相关基因表达及其诊断价值

蔡东红¹,李青¹,柯铃铃¹,钟慧雅¹,江其龙²,张涵³,宋雅芳¹()

^1.广州中医药大学科技创新中心广州中医药大学脾胃研究所，广东广州 510405
^2.广州中医药大学第一附属医院脾胃病科，广东广州 510405
^3.广东药科大学中药学院，广东广州 510405

收稿日期:2023-04-21 出版日期:2024-03-28 发布日期:2024-04-28
通讯作者: 宋雅芳 E-mail:sallysongyue@163.com
作者简介:蔡东红（1992－），女，广东省揭阳市人，医学硕士，主要从事脾胃病与神经肌肉病的基础与临床方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82374391);广东省科技厅自然科学基金面上项目(2023A1515011127);广东省教育厅生物医药与健康重点领域专项(2021ZDZX2032)

Expression of mitophagy and apoptosis related genes in peripheral blood mononuclear cells of patients with myasthenia gravis and its clinical diagnosis value

Donghong CAI¹,Qing LI¹,Lingling KE¹,Huiya ZHONG¹,Qilong JIANG²,Han ZHANG³,Yafang SONG¹()

^1.Science and Technology Innovation Center，Institute of Spleen and Stomach Diseases，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China
^2.Department of Spleen and Stomach Diseases，First Affiliated Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China
^3.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510405，China

Received:2023-04-21 Online:2024-03-28 Published:2024-04-28
Contact: Yafang SONG E-mail:sallysongyue@163.com

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨重症肌无力（MG）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中线粒体自噬和凋亡相关基因的表达水平，阐明其对MG诊断的指导价值。方法收集并提取50名健康对照者（对照组）和50例MG患者（MG组）的PBMCs，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和Western blotting法检测线粒体自噬因子磷脂酶和张力蛋白同源物（PTEN）诱导激酶1（PINK1）、E3泛素连接酶PARK2（Parkin）、泛素结合蛋白62（p62）、微管相关蛋白1轻链3（LC3Ⅱ）及凋亡因子细胞色素C（Cyt-C）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关Ｘ蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶 3（caspase 3）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶 9（caspase 9）的mRNA以及蛋白表达水平，根据mRNA检测结果设定多个不同临界值，在每个临界值处计算出相应的灵敏度和特异度，并绘制受试者工作特征（ROC）曲线。结果与对照组比较，MG组患者PBMCs中的自噬因子PINK1、Parkin和LC3Ⅱ的mRNA及蛋白表达水平明显降低（P<0.01），p62 mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.05或P<0.01）；凋亡因子Cyt-C、Bax、caspase 3和caspase 9 mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01），Cyt-C mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.05或P<0.01），而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。ROC曲线检测，PINK1、Parkin、p62和LC3Ⅱ的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.969 6（95%CI：0.943 5~0.995 7）、0.944 0（95%CI：0.904 7~0.983 3）、0.855 6（95%CI：0.776 7~0.934 5）及0.908 8（95%CI：0.852 6~0.965 0）（P<0.01），灵敏度分别为92%、92%、78%和84%，特异度分别为88%、82%、92%和82%；而Cyt-C、Bax、Bcl-2、caspase 3和caspase 9的AUC均为1.000（P<0.01），灵敏度和特异度均达到100%。结论 MG患者PBMCs中存在线粒体自噬障碍和凋亡增加现象，其对临床诊断MG具有较高的指导价值。

关键词: 重症肌无力, 线粒体自噬, 细胞凋亡, 外周血单个核细胞, 诊断价值

Abstract:

Objective To discuss the expression levels of mitochondrial autophagy and apoptosis-related genes in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） in the patients with myasthenia gravis （MG），and to clarify its diagnostic value for MG. Methods The PBMCs from 50 healthy controls （control group） and 50 MG patients （MG group） were collected and extracted. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blotting methods were used to detect the expression levels of mitochondrial autophagy factors phosphatase and tensin homolog （PTEN）-induced kinase 1 （PINK1）， E3 ubiquitin-protein ligase PARK2 （Parkin）， ubiquitin-binding protein p62 （p62）， microtubule-associated proteins light chain 3 type Ⅱ （LC3Ⅱ）， and apoptotic factors cytochrome C （Cyt-C）， B cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， cysteine-containing aspartic acid protease 3 （caspase 3）， and cysteine-containing aspartic acid protease 9 （caspase 9） mRNA and protein. Different cut-off values were set based on the mRNA detection results， and the corresponding sensitivity and specificity at each cut-off value were calculated. The receiver operating characteristic （ROC） curve was drawn. Results Compared with control group， the expression levels of autophagy factors PINK1， Parkin， and LC3Ⅱ mRNA and protein in the PBMCs in MG group were significantly decreased （P<0.01）， while the expression levels of p62 mRNA and protein were increased （P<0.05 or P<0.01）. The expression levels of apoptotic factors Cyt-C， Bax， caspase 3， and caspase 9 mRNA and protein were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， and while the expression levels of Cyt-C mRNA and protein were increased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein were significantly decreased （P<0.01）. The ROC curve analysis results showed that the area under the curve （AUC） for PINK1， Parkin， p62， and LC3Ⅱ were 0.969 6 （95%CI： 0.943 5-0.995 7）， 0.944 0 （95%CI： 0.904 7-0.983 3）， 0.855 6 （95%CI： 0.776 7-0.934 5）， and 0.908 8 （95%CI： 0.852 6-0.965 0）（P<0.01）， respectively，and the sensitivities were 92%， 92%， 78%， and 84%， and the specificities were 88%， 82%， 92%， and 82%， respectively； whereas the AUC for Cyt-C， Bax， Bcl-2， caspase 3， and caspase 9 was 1.000 （P<0.01）， and the sensitivity and specificity reached 100%. Conclusion Mitochondrial autophagy disorder and increased apoptosis are found in the PBMCs in the patients with MG， which has a higher guiding value for clinical diagnosis of MG.

Key words: Myasthenia gravis, Mitophagy, Apoptosis, Peripheral blood mononuclear cell, Diagnostic value

中图分类号:

R746.1

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图/表 6

表1

表2

表3

图1

图2

图3

参考文献 22

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Gene	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
PINK1	GTGGACCATCTGGTTCAACAGG	GCAGCCAAAATCTGCGATCACC
Parkin	CCAGAGGAAAGTCACCTGCGAA	CTGAGGCTTCAAATACGGCACTG
p62	AAGCCGGGTGGGAATGTTG	GCTTGGCCCTTCGGATTCT
LC3Ⅱ	AAGGCGCTTACAGCTCAATG	CTGGGAGGCATAGACCATGT
caspase 3	ATTGTGGAATTGATGCGTGA	GGCAGGCCTGAATAATGAAA
caspase 9	GCTGTTCAGGCCCCATATGAT	GGACTCACGGCAGAAGTTCA
Bcl-2	CATGTGTGTGGAGAGCGTCA	TCACTTGTGGCCCAGATAGG
Bax	TTTGCTTCAGGGTTTCATCC	GGAGGAAGTCCAATGTCCAG
Cyt-C	GCGTGTCCTTGGACTTAGAG	GGCGGCTGTGTAAGAGTATC
GAPDH	GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG	ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA

Group	PINK1	Parkin	p62	LC3Ⅱ
Control	0.969±0.274	0.985±0.286	0.931±0.328	1.037±0.344
MG	0.425±0.166^*	0.486±0.198^*	1.646±0.535^*	0.537±0.198^*

Group	Cyt-C mRNA	Bax mRNA	Bcl-2 mRNA	Caspase 3 mRNA	Caspase 9 mRNA
Control	1.000±0.141	1.000±0.147	1.000±0.144	1.000±0.128	1.000±0.129
MG	1.994±0.104^*	2.022±0.145^*	0.536±0.079^*	1.999±0.135^*	2.025±0.120^*

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Expression of mitophagy and apoptosis related genes in peripheral blood mononuclear cells of patients with myasthenia gravis and its clinical diagnosis value

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