沉默FOXO1基因对人主动脉血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

doi:10.13481/j.1671-587X.20240216

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨叉头框转录因子O1（FOXO1）基因对腹主动脉瘤（AAA）血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响，阐明其可能的作用机制。方法收集19例AAA患者动脉瘤组织（AAA组）及邻近正常主动脉组织（对照组），采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平，透射电镜观察2组研究对象动脉瘤组织中自噬溶酶体形成情况；Western blotting法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1及自噬相关蛋白卷曲螺旋肌球蛋白样B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）结合蛋白（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3 α（LC3）和P62蛋白表达水平。体外培养人主动脉血管平滑肌细胞（hVSMCs），并采用FOXO1 siRNA（si-FOXO1）及其阴性对照（si-NC）慢病毒感染hVSMCs，10 μmol·L^－1血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）联合自噬激活剂雷帕霉素（Rap）进行干预，将细胞分为空白对照组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+si-NC组、Ang Ⅱ+si-FOXO1组、Ang Ⅱ+si-NC+Rap组和Ang Ⅱ+si-FOXO1+Rap组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性，流式细胞术检测各组细胞凋亡水平，ELISA法检测各组细胞上清中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）水平，RT-qPCR法检测各组细胞中FOXO1 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中FOXO1、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase-3）、Beclin1、LC3和P62蛋白表达水平。结果与对照组比较，AAA组动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平升高（P<0.05），自噬溶酶体数量增多（P<0.05），Beclin1蛋白表达水平和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高（P<0.05），P62蛋白表达水平降低（P<0.05）。与空白对照组比较，Ang Ⅱ组hVSMCs增殖活性降低（P<0.05），细胞凋亡率升高（P<0.05），细胞上清中MMP-2和MMP-9水平升高（P<0.05），细胞中Bax、Cleaved caspase-3和Beclin1蛋白表达水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高（P<0.05），Bcl-2和P62蛋白表达水平降低（P<0.05）；与Ang Ⅱ+si-NC组比较，Ang Ⅱ+si-FOXO1组hVSMCs增殖活性升高（P<0.05），细胞凋亡率降低（P<0.05），细胞上清中MMP-2和MMP-9水平降低（P<0.05），细胞中Bax、Cleaved-caspase-3和Beclin1蛋白表达水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低（P<0.05），Bcl-2和P62蛋白表达水平升高（P<0.05）。与Ang Ⅱ+ si-FOXO1组比较，Ang Ⅱ+si-FOXO1+Rap组细胞凋亡率升高（P<0.05），细胞上清中MMP-2和MMP-9水平升高（P<0.05），细胞中Beclin1蛋白表达水平和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低（P<0.05），P62蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论 FOXO1基因沉默可能通过降低自噬水平来提高Ang Ⅱ暴露下hVSMCs增殖活性，并抑制其凋亡，从而参与AAA的发病。

关键词: 腹主动脉瘤, 人血管平滑肌细胞, 叉头框转录因子O1, 自噬, 细胞凋亡

Abstract:

Objective To discuss the effect of forkhead box O1 （FOXO1） gene on the autophagy and apoptosis of the vascular smooth muscle cells in abdominal aortic aneurysm （AAA）， and to clarify its possible mechanism. Methods ^{The aneurysm tissue of nineteen AAA patients （AAA group） and adjacent normal aortic tissue of nineteen AAA patients （control group） were collected. Real-time fluorenscence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression level of FOXO1 mRNA in aneurysm tissue of the subjects in two groups； transmission electron microscope was used to observe the autophagolysosome formation in aneurysm tissue of the subjects in two groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of FOXO1 and autophagy-related proteins B cell lymphoma-2（Bcl-2）-binding protein（Beclin1）， microtubule-associated protein 1 light chain 3α （LC3）， and P62 proteins in aneurysm tissue of the subjects in two groups. The human aortic vascular smooth muscle cells （hVSMCs） were cultured in vitro and infected with FOXO1 siRNA （si-FOXO1） and its negative control （si-NC） lentivirus， then treated with 10 μmol·L^－1 angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ） combined with autophagy activator rapamycin （Rap）. The cells were divided into blank control group， Ang Ⅱ group， Ang Ⅱ+ si-NC group， Ang Ⅱ + si-FOXO1 group， Ang Ⅱ+ si-NC + Rap group， and Ang Ⅱ+ si-FOXO1 + Rap group.CCK-8 assay was used to detect the proliferation activities of the cells in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the cells in various groups； ELISA method was used to detect the levels of matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） and matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） in the cell supernatant in various groups； RT-qPCR method was used to detect the expression level of FOXO1 mRNA in the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of FOXO1， Bcl-2， Bcl-2 associated X prorein（Bax）， Cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-3 （Cleaved caspase-3）， Beclin1， LC3， and P62 proteins in the cells in various groups. Results Compared with control group， the expression level of FOXO1 mRNA in aneurysm tissue of the subjects in AAA group was increased （P<0.05）， the number of autophagolysosomes was increased （P<0.05）， the levels of Beclin1 protein and the ratio of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ were increased （P<0.05）， and the expression level of P62 protein was decreased （P<0.05）. Compared with blank control group， the proliferation activity of the hVSMCs in Ang Ⅱ group was decreased （P<0.05）， the apoptotic rate of the cells was increased （P<0.05）， the levels of MMP-2 and MMP-9 in the cell supernatant were increased （P<0.05）， the expression levels of Bax， Cleaved caspase-3， and Beclin1 proteins in the cells and the ratio of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ were increased （P<0.05）， and the expression levels of Bcl-2 and P62 proteins were decreased （P<0.05）. Compared with Ang Ⅱ+ si-NC group， the proliferation activity of the hVSMCs in Ang Ⅱ+ si-FOXO1 group was increased （P<0.05）， the apoptotic rate of the cells was decreased （P<0.05）， the levels of MMP-2 and MMP-9 in the cell supernatant were decreased （P<0.05）， the expression levels of Bax， cleaved caspase-3， and Beclin1 proteins in the cells and the ratio of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ were decreased （P<0.05）， and the expression levels of Bcl-2 and P62 proteins were increased （P<0.05）. Compared with Ang Ⅱ+ si-FOXO1 group， the apoptotic rate of the hVSMCs in Ang Ⅱ+ si-FOXO1 + Rap group was increased （P<0.05）， the levels of MMP-2 and MMP-9 in the cell supernatant were increased （P<0.05）， the expression level of Beclin1 protein in the cells and the ratio of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ were decreased （P<0.05）， and the expression level of P62 protein was increased （P<0.05）. Conclusion Silencing the FOXO1 gene may increase the proliferation activity of the hVSMCs exposed to Ang Ⅱ by reducing the autophagy level and inhibiting the apoptosis， thus participating in the pathogenesis of AAA.}

Key words: Abdominal aortic aneurysm, Human vascular smooth muscle cell, Forkhead box transcription factor O1, Autophagy, Apoptosis

中图分类号:

R732.2

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参考文献 23

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Group	MMP-2 level	MMP-9 level
Blank control	1.10±0.10	0.50±0.04
Ang Ⅱ	5.30±0.40^*	2.10±0.20^*
Ang Ⅱ+si-NC	5.50±0.50	2.20±0.10
Ang Ⅱ+si-FOXO1	1.80±0.20^△	0.80±0.09^△

Group	MMP-2 level	MMP-9 level
Ang Ⅱ+si-NC	5.80±0.70	2.10±0.10
Ang Ⅱ+si-FOXO1	1.60±0.20^*	0.90±0.10^*
Ang Ⅱ+si-NC+Rap	8.20±0.60^*	3.40±0.30^*
Ang Ⅱ+si-FOXO1+Rap	6.10±0.40^△	1.00±0.09^△

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