异菌脲对小鼠精母细胞GC-2铁死亡的影响

doi:10.13481/j.1671-587X.20260104

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨异菌脲（Ipr）对小鼠精母细胞GC-2铁死亡的影响，并阐明其可能的作用机制。方法采用噻唑蓝（MTT）法检测0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000和100.000 μmol·L^-1 Ipr处理24 h后GC-2细胞活性。另取GC-2细胞，分为空白对照组、1.0 μmol·L^-1 Ipr组、2.5 μmol·L^-1 Ipr组和5.0 μmol·L^-1 Ipr组（分别加入终浓度为0、1.0、2.5和5.0 μmol·L^-1的Ipr溶液处理24 h）。采用荧光显微镜观察细胞中活性氧（ROS）生成和线粒体膜电位；采用试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平及还原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值，Western blotting法检测Ipr暴露后各组GC-2细胞中铁死亡相关蛋白表达水平，免疫荧光法检测各组GC-2细胞中血红素加氧酶1（HO-1）蛋白荧光强度。结果 MTT法，与0 μmol·L^-1 Ipr组比较，1.000、10.000和100.000 μmol·L^-1 Ipr组GC-2细胞活性明显降低（P<0.01），后续实验选择1.0、2.5和5.0 μmol·L^-1 Ipr作用GC-2细胞。荧光检测法，与空白对照组比较，2.5和5.0 μmol·L^-1 Ipr处理GC-2细胞可促进ROS生成并降低线粒体膜电位；1.0 μmol·L^-1 Ipr组GC-2细胞中MDA水平和SOD活性及GSH/GSSG比值均无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），2.5和5.0 μmol·L^-1 Ipr组GC-2细胞中MDA水平明显升高（P<0.05或P<0.01），SOD活性和GSH/GSSG比值明显降低（P<0.01）。Western blotting法，与空白对照组比较，作用24 h后1.0 μmol·L^-1 Ipr组GC-2细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和铁蛋白重链1（FTH1）蛋白表达水平均无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），作用24 h后2.5和5.0 μmol·L^-1 Ipr组GC-2细胞中GPX4和FTH1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），作用24 h后1.0、2.5和5.0 μmol·L^-1 Ipr组GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。免疫荧光法，与空白对照组比较，1.0、2.5和5.0 μmol·L^-1 Ipr组GC-2细胞中HO-1蛋白荧光强度明显增强。结论 Ipr导致小鼠精母细胞GC-2铁死亡，其机制可能与上调HO-1蛋白表达以及下调GPX4和FTH1蛋白表达有关。

关键词: 铁死亡, 小鼠精母细胞GC-2, 异菌脲, 谷胱甘肽过氧化物酶4, 铁蛋白重链1, 血红素加氧酶1

Abstract:

Objective To discuss the effect of iprodione （Ipr） on ferroptosis in mouse spermatocyte GC-2 cells， and to clarify its possible mechanism. Methods The MTT method was used to detect the viability of GC-2 cells after treatment with 0， 0.001， 0.010， 0.100， 1.000， 10.000， and 100.000 μmol·L^-1 Ipr for 24 h. Additional GC-2 cells were taken and divided into blank control group， 1.0 μmol·L^-1 Ipr group， 2.5 μmol·L^-1 Ipr group， and 5.0 μmol·L^-1 Ipr group （treated with Ipr solutions at final concentrations of 0， 1.0， 2.5， and 5.0 μmol·L^-1， respectively， for 24 h）. Fluorescence microscope was used to observe the intracellular reactive oxygen species （ROS） generation and mitochondrial membrane potential changes； Kit methods were used to detect the superoxide dismutase （SOD）activity， malondialdehyde （MDA） level， and the reduced glutathione （GSH）/oxidized glutathione （GSSG） ratio in the GC-2 cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of ferroptosis-related proteins in the GC-2 cells in various groups after Ipr exposure； immunofluorescence method was used to detect the fluorescence intensity of heme oxygenase-1 （HO-1） protein in the GC-2 cells in various groups. Results The MTT assay results showed that compared with 0 μmol·L^-1 Ipr group， the viabilities of the GC-2 cells in 1.000， 10.000， and 100.000 μmol·L^-1 Ipr groups were significantly decreased （P<0.01）； thus， 1.0， 2.5， and 5.0 μmol·L^-1 Ipr were selected for subsequent experiments on GC-2 cells. The fluorescence analysis results showed that compared with blank control group， the ROS generation in the GC-2 cells in 2.5 and 5.0 μmol·L?1 Ipr groups was increased and the mitochondrial membrane potentials were decreased； there were no significant changes in the MDA level， SOD activity， and GSH/GSSG ratio in the GC-2 cells in 1.0 μmol·L^-1 Ipr group （P>0.05）； compared with blank control group， the MDA levels in the GC-2 cells in 2.5 and 5.0 μmol·L^-1 Ipr groups were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， and the SOD activities and GSH/GSSG ratios were significantly decreased （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with blank control group， after 24 h of treatment， the expression levels of glutathione peroxidase 4 （GPX4） and ferritin heavy chain 1 （FTH1） proteins in the GC-2 cells in 1.0 μmol·L^-1 Ipr group showed no significant changes （P>0.05）； compared with blank control group， after 24 h of treatment， the expression levels of GPX4 and FTH1 proteins in the GC-2 cells in 2.5 and 5.0 μmol·L?1 Ipr groups were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）； compared with blank control group， after 24 h of treatment， the expression levels of HO-1 protein in the GC-2 cells in 1.0， 2.5， and 5.0 μmol·L^-1 Ipr groups were significantly increased （P<0.01）. The immunofluorescence results showed that compared with blank control group， the fluorescence intensities of HO-1 protein in the GC-2 cells in 1.0， 2.5， and 5.0 μmol·L^-1 Ipr groups were significantly enhanced. Conclusion Ipr induces ferroptosis in mouse spermatocyte GC-2 cells， and its mechanism may be related to the up-regulation of HO-1 protein expression and the down-regulation of GPX4 and FTH1 protein expressions.

Key words: Ferroptosis, Mouse spermatocyte GC-2, Iprodione, Glutathione peroxidase 4, Ferritin heavy chain 1, Heme oxygenase-1

中图分类号:

R966

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图/表 7

表1

表2

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Concentration of Ipr (μmol·L^-1)	Cell activity
0	100.00±2.75
0.001	99.29±4.43
0.010	99.04±3.13
0.100	97.49±4.41
1.000	85.64±3.00^*
10.000	67.70±3.82^*
100.000	31.08±4.68^*

Group	SOD activity [λ_B/(U·mg^-1)]	MDA level [λ_B/(mol·g^-1)]	Ratio of GSH/GSSG
Black control	74.6±2.8	5.82±0.55	1.35±0.44
1.0 μmol·L^-1 Ipr	71.8±5.2	7.07±1.24	1.10±0.02
2.5 μmol·L^-1 Ipr	56.9±3.8^**	9.73±1.31^*	0.45±0.05^**
5.0 μmol·L^-1 Ipr	46.3±1.2^**	12.91±2.79^**	0.09±0.05^**

Group	HO-1	GPX4	FTH1
Blank control	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
1.0 μmol·L^-1 Ipr	1.22±0.04^**	0.83±0.21	0.98±0.12
2.5 μmol·L^-1 Ipr	1.37±0.06^**	0.62±0.07^**	0.71±0.22^*
5.0 μmol·L^-1 Ipr	1.53±0.12^**	0.55±0.07^**	0.49±0.07^**