敲低RIP3对缺氧/复氧诱导人肾小管上皮HK2细胞自噬、细胞焦亡和铁死亡的影响

doi:10.13481/j.1671-587X.20240618

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨敲低受体相互作用蛋白激酶3（RIP3）对缺氧复氧（H/R）诱导下人肾小管上皮HK2细胞自噬、焦亡和铁死亡的影响。方法将慢病毒干扰载体质粒shRIP3和阴性对照慢病毒干扰载体质粒shNC分别转染至HK2细胞中，分为shRIP3组和shNC组，另以正常培养未转染的HK2细胞作为空白组，转染48 h后，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和Western blotting法验证慢病毒转染效果。将HK2细胞分为对照组、H/R组、shNC+H/R组和shRIP3+H/R组。CCK-8法检测各组HK2细胞存活率，免疫荧光染色法检测各组细胞中微管结合蛋白1轻链（LC）3B和含核苷酸结合结构域富亮氨酸重复序列（NLR）家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）蛋白荧光强度，Western blotting法检测各组HK2细胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1、膜穿孔蛋白D（GSDMD）、白细胞介素（IL）-1β和IL-18蛋白表达水平，试剂盒检测各组细胞中铁离子（Fe²⁺）水平。结果与空白组和shNC组比较，shRIP3组HK2细胞中RIP3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。CCK-8法检测，与对照组比较，H/R组HK2细胞存活率明显降低（P<0.05）；与H/R组比较，shRIP3+H/R组HK2细胞存活率明显升高（P<0.05）。免疫荧光染色法检测，与对照组比较，H/R组HK2细胞中LC3B蛋白荧光强度明显降低（P<0.05），NLRP3蛋白荧光强度明显升高（P<0.05）；与H/R组比较，shRIP3+H/R组HK2细胞中LC3B蛋白荧光强度明显升高（P<0.05），NLRP3蛋白荧光强度明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测，与对照组比较，H/R组HK2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低（P<0.05），Beclin1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与H/R组比较，shRIP3+H/R组HK2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高（P<0.05），Beclin1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与对照组比较，H/R组HK2细胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）；与H/R组比较，shRIP3+H/R组HK2细胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。与对照组比较，H/R组HK2细胞中GPX4和SLC7A11蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与H/R组比较，shRIP3+H/R组HK2细胞中GPX4和SLC7A11蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。与对照组比较，H/R组HK2中细胞Fe²⁺水平明显升高（P<0.05）；与H/R组比较，shRIP3+H/R组HK2细胞中Fe²⁺水平明显降低（P<0.05）。结论靶向敲低RIP3可诱导H/R诱导人肾小管上皮HK2细胞自噬，抑制细胞焦亡和减轻铁死亡。

关键词: 人肾小管上皮HK2细胞, 缺氧/复氧, 受体相互作用蛋白激酶3, 自噬, 焦亡, 铁死亡

Abstract:

Objective To discuss the effect of knockdown of receptor-interacting protein kinase 3 （RIP3） on autophagy， pyroptosis， and ferroptosis in the human renal tubular epithelial HK2 cells under hypoxia/reoxygenation （H/R） conditions. Methods The lentiviral interference vector plasmid shRIP3 and negative control lentiviral interference vector plasmid shNC were transfected into the HK2 cells and the HK cells were divided into shRIP3 group and shNC group， and the normal cultured untransfected HK2 cells were regarded as blank group. After 48 h of transfection， real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blotting methods were used to verify the lentiviral transfection efficiencies. The HK2 cells were divided into control group， H/R group， shNC+H/R group， and shRIP3+H/R group. CCK-8 method was used to detect the survival rates of the HK2 cells in various groups； immunofluorescence staining was used to detect the fluorescence intensities of light chain 3 （LC3B） and NLR family pyrin domain-containing 3 （NLRP3） proteins in the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of LC3Ⅱ， LC3Ⅰ， Beclin1， Caspase-1， Gasdermin D （GSDMD）， interleukin （IL）-1β， and IL-18 proteins in the HK2 cells in various groups； Kits were used to detect the ferri ion（Fe²⁺） levels in the cells in various groups. Results Compared with blank group and shNC group， the expression levels of RIP3 mRNA and protein in the HK2 cells in shRIP3 group were decreased （P<0.05）.The CCK-8 method results showed that compared with control group， the survival rate of the HK2 cells in H/R group was decreased （P<0.05）； compared with H/R group， the survival rate of the HK2 cells in shRIP3+H/R group was increased （P<0.05）. The immunofluorescence staining results showed that compared with control group， the fluorescence intensity of LC3B protein in the HK2 cells in H/R group was decreased （P<0.05）， and the fluorescence intensity of NLRP3 protein was increased （P<0.05）； compared with H/R group， the fluorescence intensity of LC3B protein in the HK2 cells in shRIP3+H/R group was increased （P<0.05）， and the fluorescence intensity of NLRP3 protein was decreased （P<0.05）. The Western blotting results showed that compared with control group， the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and the expression level of Beclin1 protein in the HK2 cells in H/R group were decreased （P<0.05）； compared with H/R group， the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and expression level of Beclin1 protein in the HK2 cells in shRIP3+H/R group were increased （P<0.05）； compared with control group， the expression levels of Caspase-1， GSDMD， IL-1β， and IL-18 proteins in the HK2 cells in H/R group were increased （P<0.05）； compared with H/R group， the expression levels of Caspase-1， GSDMD， IL-1β， and IL-18 proteins in the HK2 cells in shRIP3+H/R group were decreased （P<0.05）. Compared with control group， the expression levels of GPX4 and SLC7A11 proteins in the HK2 cells in H/R group were decreased （P<0.05）； compared with H/R group， the expression levels of GPX4 and SLC7A11 proteins in the HK2 cells in shRIP3+H/R group were increased （P<0.05）. Compared with control group， the Fe²⁺ level in the HK2 cells in H/R group was increased （P<0.05）； compared with H/R group， the Fe²⁺ level in the HK2 cells in shRIP3+H/R group was decreased （P<0.05）. Conclusion Targeted knockdown of RIP3 can induce the autophagy， inhibit the pyroptosis， and reduce the ferroptosis of the human renal tubular epithelial HK2 cells induced by H/R.

Key words: Human renal tubular epithelial HK2 cells, Hypoxia/reoxygenation, Receptor-interacting protein kinase 3, Autophagy, Pyroptosis, Ferroptosis

中图分类号:

R692

何国斌,王焕. 敲低RIP3对缺氧/复氧诱导人肾小管上皮HK2细胞自噬、细胞焦亡和铁死亡的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(6): 1644-1653.

Guobin HE,Huan WANG. Effect of knockdown of RIP3 on autophagy, pyroptosis， and ferroptosis of hypoxia/reoxygenation-induced human renal tubular epithelial HK2 cells[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2024, 50(6): 1644-1653.

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参考文献 24

1	CLARE C S. Identifying and managing acute kidney injury［J］. Nurs Stand， 2022， 37（9）： 59-66.
2	MENON S， SYMONS J M， SELEWSKI D T. Acute kidney injury［J］. Pediatr Rev， 2023， 44（5）： 265-279.
3	GRANATA S， VOTRICO V， SPADACCINO F， et al. Oxidative stress and ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation： focus on ferroptosis， mitophagy and new antioxidants［J］. Antioxidants， 2022， 11（4）： 769.
4	KARIMI F， MALEKI M， NEMATBAKHSH M. View of the renin-angiotensin system in acute kidney injury induced by renal ischemia-reperfusion injury［J］. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst， 2022， 2022： 9800838.
5	SURESHBABU A， PATINO E， MA K C， et al. RIPK3 promotes sepsis-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction［J］. JCI Insight， 2018， 3（11）： e98411.
6	LI R Z， ZHAO X C， ZHANG S， et al. RIP3 impedes transcription factor EB to suppress autophagic degradation in septic acute kidney injury［J］. Cell Death Dis， 2021， 12（6）： 593.
7	郭玥，周宝娟，路建饶，等. 黄连素抗缺氧复氧诱导的人肾小管上皮HK-2细胞凋亡的机制［J］. 中国中西医结合肾病杂志， 2020， 21（12）： 1037-1041.
8	SPRANGERS B， LEAF D E， PORTA C， et al. Diagnosis and management of immune checkpoint inhibitor-associated acute kidney injury［J］. Nat Rev Nephrol， 2022， 18（12）： 794-805.
9	CHEN X， ZHU R F， ZHONG J J， et al. Mosaic composition of RIP1-RIP3 signalling hub and its role in regulating cell death［J］. Nat Cell Biol， 2022， 24（4）： 471-482.
10	WANG K， HU L， CHEN J K. RIP3-deficience attenuates potassium oxonate-induced hyperuricemia and kidney injury［J］. Biomed Pharmacother， 2018， 101： 617-626.
11	FENG Y S， IMAM ALIAGAN A， TOMBO N， et al. RIP3 translocation into mitochondria promotes mitofilin degradation to increase inflammation and kidney injury after renal ischemia-reperfusion［J］. Cells， 2022， 11（12）： 1894.
12	WANG L， ZHONG G D， ZHOU H， et al. Plasma levels of receptor-interacting protein kinase 3 is associated with postoperative acute kidney injury in acute DeBakey type Ⅰ aortic dissection［J］. J Cardiothorac Surg， 2022， 17（1）： 35.
13	XIANG Y， FU Y， WU W W， et al. Autophagy in acute kidney injury and maladaptive kidney repair［J］. Burns Trauma， 2023， 11： tkac059.
14	ALA M， KHOSHDEL M R F， DEHPOUR A R. Empagliflozin enhances autophagy， mitochondrial biogenesis， and antioxidant defense and ameliorates renal ischemia/reperfusion in nondiabetic rats［J］. Oxid Med Cell Longev， 2022， 2022： 1197061.
15	ZHANG S， XIA W M， DUAN H Q， et al. Ischemic preconditioning alleviates mouse renal ischemia/reperfusion injury by enhancing autophagy activity of proximal tubular cells［J］. Kidney Dis， 2022， 8（3）： 217-230.
16	HWANG H J， KIM Y K. The role of LC3B in autophagy as an RNA-binding protein［J］. Autophagy， 2023， 19（3）： 1028-1030.
17	TRAN S， FAIRLIE W D， LEE E F. BECLIN1： protein structure， function and regulation［J］. Cells， 2021， 10（6）： 1522.
18	张慧欣，辜银萍，胡宇声，等. NLRP3炎性小体和细胞焦亡在消化系统疾病中的作用机制［J］. 中国兽医杂志， 2023， 59（1）： 96-101.
19	ZHENG Y， XU X D， CHI F L， et al. Pyroptosis： a newly discovered therapeutic target for ischemia-reperfusion injury［J］. Biomolecules， 2022， 12（11）： 1625.
20	COLL R C， SCHRODER K， PELEGRÍN P. NLRP3 and pyroptosis blockers for treating inflammatory diseases［J］. Trends Pharmacol Sci， 2022， 43（8）： 653-668.
21	HOSOHATA K， HARNSIRIKARN T， CHOKESUWATTANASKUL S. Ferroptosis： a potential therapeutic target in acute kidney injury［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（12）： 6583.
22	FIORE A， ZEITLER L， RUSSIER M， et al. Kynurenine importation by SLC7A11 propagates anti-ferroptotic signaling［J］. Mol Cell， 2022， 82（5）： 920-932.
23	SUN Z J， WU J Y， BI Q， et al. Exosomal lncRNA TUG1 derived from human urine-derived stem cells attenuates renal ischemia/reperfusion injury by interacting with SRSF1 to regulate ASCL4-mediated ferroptosis［J］. Stem Cell Res Ther， 2022， 13（1）： 297.
24	LI D Y， LIU B， FAN Y M， et al. Nuciferine protects against folic acid-induced acute kidney injury by inhibiting ferroptosis［J］. Br J Pharmacol， 2021， 178（5）： 1182-1199.

[1]	马宝莲,胡晓雪,艾霄文,张永兰. 香叶木素对RSL3诱导小鼠精母细胞GC-2铁死亡的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(6): 1481-1490.
[2]	马新月,徐慧,刁佳雯,金爱花,全吉淑. 草苁蓉多糖对THP-1巨噬细胞炎症反应的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(6): 1499-1511.
[3]	姜方阳,肖静,昌贺,孙铭阳,张文静,律广富,林贺,林喆,黄晓巍,王雨辰. 玉竹多糖对顺铂诱导小鼠急性肾损伤的作用及其铁死亡机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(5): 1235-1242.
[4]	叶严珏,汤子怡,谭钰培,阳诗盈,刘永,尹俐. 硫唑嘌呤对RSL3诱导小鼠精母细胞铁死亡的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(5): 1217-1226.
[5]	彭小勇,朱娱,张双博,朱英国,李涛,刘良明,王建民,杨光明. 液体复苏抑制血管组织铁死亡对爆炸损伤并发失血性休克大鼠血管细胞结构损伤的减轻作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(5): 1227-1234.
[6]	王宇彤,冉睿黎,边疆,姜晓涵,宋俊秋,王德威,杨菁. 肌肽通过AMPK/mTOR信号通路抑制自噬对氧糖剥夺/复糖复氧诱导星形胶质细胞损伤的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(5): 1297-1304.
[7]	石玉宵,刘美岚,朱美霖,魏枫. 5-Aza-CdR对裸鼠皮下移植瘤组织中甲状腺乳头状癌细胞自噬和凋亡的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(5): 1330-1338.
[8]	魏俊萍,符达佳,孟庆雯,林道飞,林燕仔. 骨髓间充质干细胞来源外泌体对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化的影响及其作用机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(5): 1348-1357.
[9]	于国兴,张鑫,杜恒玮,崔冰洁,高娜,刘翠兰,杜静. 尿石素C对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(4): 908-916.
[10]	倪英群,杨矛,杨迪,郭呈林,朱文君,俞雅琴,卢芹,骆金芝,吴春琴,方朝晖. 高磷诱导下肢血管平滑肌细胞成骨分化关键差异表达基因筛选及验证[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(3): 620-627.
[11]	王琳茹,张晶,赵冬婵,王晋军,胡文贤. 沉默FOXO1基因对人主动脉血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(2): 431-441.
[12]	蔡东红,李青,柯铃铃,钟慧雅,江其龙,张涵,宋雅芳. 重症肌无力患者外周血单个核细胞中线粒体自噬和凋亡相关基因表达及其诊断价值[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(2): 481-488.
[13]	武梦雪,陈士玲,刘艳,米旭光,林秀英,付建华,方艳秋. 人脐带间充质干细胞培养上清对米非司酮处理的人子宫内膜基质细胞存活、凋亡和子宫内膜容受性的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(1): 79-87.
[14]	文晓东,王春玲,蒋媛静,周欣梅,张艺,伍媛. 乌梅总黄酮调控miR-145-3p表达对MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2023, 49(6): 1415-1423.
[15]	张瑞鹏,李杰. lncRNA GPRC5D-AS1对地塞米松诱导小鼠成肌细胞肌萎缩的抵抗和再生作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2023, 49(6): 1457-1465.