白芍总苷介导TLR4/NF-κB信号通路对类风湿关节炎模型大鼠的治疗作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20210219

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨白芍总苷（TGP）通过调控Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信号通路对类风湿关节炎（RA）大鼠关节情况、炎症因子及凋亡因子的影响，并阐明其作用机制。

方法

利用牛Ⅱ型胶原蛋白溶液和完全弗氏佐剂构建胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，将CIA模型大鼠随机分为CIA组、低剂量（25 mg·kg^－1）TGP组（TGP-LD组）、中剂量（50 mg·kg^－1）TGP组（TGP-MD）和高剂量（100 mg·kg^－1） TGP 组（TGP-HD组），每组10只；另选取10只健康SD大鼠作为对照组。记录各组大鼠体质量、关节炎指数及关节肿胀度；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α），白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素1β（IL-1β）水平；采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blotting法检测各组大鼠关节滑膜组织中TLR4、NF-κB、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase-3）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）mRNA和蛋白表达水平。

结果

与对照组比较，CIA组大鼠体质量和关节滑膜组织中Cleaved caspase-3和Bax mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05），关节炎指数、关节肿胀度、关节滑膜组织中Bcl-2、TLR4、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平，血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显升高（P<0.05）。与CIA组比较，不同剂量TGP组大鼠体质量和关节滑膜组织中Cleaved caspase-3及Bax mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05），关节炎指数、关节肿胀度、关节滑膜组织中Bcl-2、TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平，血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显降低（P<0.05）。与TGP-LD组比较， TGP-MD组和TGP-HD组大鼠体质量和关节滑膜组织中Cleaved caspase-3及Bax mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05），关节炎指数、关节肿胀度、关节滑膜组织中Bcl-2、TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平，血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显降低（P<0.05）。

结论

TGP可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，改善CIA症状，降低炎症反应，并促进关节滑膜组织细胞的凋亡。

关键词: 白芍总苷, Toll样受体4, 核因子κB, 类风湿关节炎, 炎症, 滑膜

Abstract: Objective

To investigate the effects of total glucosides of paeony （TGP） on joint condition， inflammatory factors and apoptosis factors in the rheumatoid arthritis （RA） rats by regulating the Toll-like receptor 4（TLR4） /nuclear factor-κB（NF-κB） signaling pathway， and to clarify its mechanism.

Methods

The collagen-induced arthritis （CIA） rat models were established with bovine type Ⅱ collagen and complete Freund’s adjuvant， and the CIA model rats were randomly divided into CIA group， low dose （25 mg·kg^－1）of TGP（TGP-LD） group， middle dose （50 mg·kg^－1） of TGP（TGP-MD） group， and high dose （100 mg·kg^－1） of TGP（TGP-HD）， with 10 rats in each group.Another 10 healthy SD rats were selected as control group . The body weights， arthritis indexes and joint swelling degrees of the rats in each group were measured， and the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α），interleukin-6 （IL-6） and interleukin-1β （IL-1β） in serum of the rats in each group were detected by ELISA method. The mRNA and protein expression levels of TLR4， NF-κB， Cleaved caspase-3， B cell lymphoma -2 （Bcl-2） and Bcl-2 associated X protein （Bax） in joint synovium tissue of the rats in each group were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） and Western blotting methods.

Results

Compared with control group， the body weight and the expression levels of Cleaved caspase-3 and Bax mRNA and proteins in joint synovium tissue of the rats in CIA group were significantly decreased （P<0.05）， while the arthritis index， the joint swelling degree， the expression levels of Bcl-2， TLR4，and NF-κB p65 mRNA and proteins in joint synovium tissue， and the TNF-α， IL-6， and IL-1β levels in serum of the rats in CIA group were significantly increased （P<0.05）. Compared with CIA group，the body weights and the expression levels of Cleaved caspase-3 and Bax mRNA and protein in joint synovium tissue of the rats in different doses of TGP groups were significantly increased（P<0.05）， while the arthritis indexes，the joint swelling degrees， the expression levels of Bcl-2， TLR4，and NF-κB p65 mRNA and proteins in joint synovium tissue， and the TNF-α， IL-6， IL-1β levels in serum of the rats were significantly decreased（P<0.05）.Compared with TGP-LD group，the body weights and the expression levels of Cleaved caspase-3 and Bax mRNA and proteins in joint synovium tissue of the rats in TGP-MD group and TGP-HD group were significantly increased（P<0.05），while the arthritis indexes， the joint swelling degrees， the expression levels of TLR4，NF-κB，p65 and Bcl-2 in joint synovium tissue， and the TNF-α， IL-6， and IL-1β levels in serum of the rats were significantly decreased（P<0.05）.

Conclusion

TGP can improve the symptoms of CIA， reduce the inflammatory reaction and promote the apoptosis of synovial tissue by inhibiting TLR4/NF- κB signal pathway.

Key words: total glucoside of paeony, Toll-like receptor 4, nuclear factor-κB, rheumatoid arthritis, inflammation, synovial

中图分类号:

R684.3

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图/表 8

表1

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参考文献 22

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Primer	Sequence (5'－3')
NF-κB p65	Forward:ACGATCTGTTTCCCCTCATC
NF-κB p65	Reserse: TGCTTCTCTCCCCAGGAATA
TLR4	Forward:TTGCCTTCATTACAGGGACTT
TLR4	Reserse: AGATACCGGTGGAGGCTGACT
Cleaved caspase-3	Forward: AGATGGTTTGAGCCTGAGCA
Cleaved caspase-3	Reserse: CAGTGCGTATGGAGAAATGG
Bax	Forward: GAGACACCTGAGCTGACCTTG
Bax	Reserse: GCTCCATGTTGTTGTCCAGTT
Bcl-2	Forward: GGTGAACTGGGGGAGGATTG
Bcl-2	Reserse: AGAGCGATGTTGTCCACCAG
β-actin	Forward:GCCATGTACGTAGCCATCCA
	Reserse: GAACCGCTCATTGCCGATAG

Group	TNF-α	IL-6	IL-1β
Control	49.31±4.82	28.64±3.06	21.17±1.29
CIA	107.63±16.29^*	83.43±10.02^*	68.35±9.63^*
TGP-LD	79.26±8.20^△	64.57±7.79^△	57.68±6.26^△
TGP-MD	64.11±7.13^△#	60.32±7.25^△#	42.44±5.03^△#
TGP-HD	58.20±5.61^△#	42.64±5.87^△#	37.29±2.51^△#

Group	Cleaved caspase-3	Bax	Bcl-2
Control	1.00±0.02	0.99±0.04	1.01±0.03
CIA	0.41±0.05^*	0.35±0.05^*	2.95±0.24^*
TGP-LD	0.56±0.07^△	0.54±0.07^△	2.46±0.17^△
TGP-MD	0.75±0.04^△#	0.63±0.05^△#	2.07±0.15^△#
TGP-HD	0.86±0.06^△#	0.82±0.09^△#	1.69±0.18^△#

Group	Cleaved caspase-3	Bax	Bcl-2
Control	0.63±0.05	0.66±0.08	0.82±0.07
CIA	0.38±0.04^*	0.26±0.04^*	1.98±0.32^*
TGP-LD	0.47±0.06^△	0.41±0.02^△	1.67±0.21^△
TGP-MD	0.60±0.09^△#	0.47±0.04^△#	1.34±0.16^△#
TGP-HD	0.69±0.12^△#	0.56±0.07^△#	0.97±0.12^△#

Group	TLR4 mRNA	NF-κB p65 mRNA	TLR4 protein	NF-κB p65 protein
Control	1.01±0.03	1.00±0.05	0.52±0.08	0.31±0.04
CIA	3.65±0.38^*	2.78±0.21^*	1.02±0.11^*	0.78±0.06^*
TGP-LD	3.18±0.29^△	2.25±0.23^△	0.89±0.08^△	0.63±0.05^△
TGP-MD	2.74±0.20^△#	1.98±0.17^△#	0.77±0.05^△#	0.55±0.05^△#
TGP-HD	1.73±0.15^△#	1.36±0.11^△#	0.48±0.04^△#	0.35±0.04^△#