针药并用诱导自噬对ApoE基因敲除小鼠认知功能的影响

doi:10.13481/j.1671-587x.20200603

摘要/Abstract

摘要： 目的

观察针药并用干预手段对ApoE基因敲除小鼠海马组织中自噬水平的影响，探讨针药并用干预手段通过磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路发挥调控自噬的作用机制。

方法

50只8周龄ApoE基因敲除小鼠高脂饲料喂养，16周后随机分为模型组、低剂量中药组、高剂量中药组、针药组和针刺组，每组10只；10只同龄C57BL/6L小鼠采用普通饲料喂养作为对照组。第 17周起，除对照组外其他各组小鼠给予相应干预因素干预8周。干预结束后，采用水迷宫法观察各组小鼠逃避潜伏期，透射电镜下观察各组小鼠海马组织的超微结构，Western blotting和免疫组织化学法检测小鼠海马组织中PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平。

结果

水迷宫实验，模型组小鼠逃避潜伏期较对照组明显延长（P<0.05），针药组小鼠逃避潜伏期较模型组明显缩短（P<0.05）。透射电镜下，模型组小鼠海马组织中神经元出现变形、不规则或萎缩，核膜粗糙不完整、双层结构模糊，胞质内自噬泡减少；针药组小鼠海马组织中神经元仍有部分不规则变形、萎缩，胞质内可见自噬泡。Western blotting和免疫组织化学检测，与对照组比较，模型组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，各剂量中药组、针刺组和针药组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR的蛋白表达水平降低（P<0.05），以针药组最为明显（P<0.05）。

结论

针药并用可改善ApoE基因敲除小鼠认知功能，其作用机制可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路的过度活化而促进海马细胞自噬来实现的。

关键词: 针刺, 中药, 认知功能, 自噬, 磷脂酰肌醇-3-激酶, 蛋白激酶B, 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

Abstract: Objective

To observe the effect of acupuncture combined with medicine on the autophagy in hippocampus tissue of the mice with ApoE gene knockout， and to explore the mechanism of acupuncture combined with medicine in regulating the autophagy through the phosphatidylinosital-3-kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）-mamalian target of repamycin（mTOR） signaling pathway.

Methods

Fifty 8-week-old ApoE gene knockout mice were fed with high-fat diet， and after 16 weeks， the ApoE gene knockout mice were randomly divided into model group， low dose of traditional Chinese medicine（TCM） group， high dose of TCM group， acupuncture group， acupuncture+ TCM group；there were 10 rats in each group.Another 10 C57BL/6L mice with the same age fed with normal diet were regarded as control group. From the 17th week， the mice in each group except blank group were given intervention for 8 weeks. After the intervention， the escape latency time of the mice in various groups was observed by Water Maze experiment； the ultrastructures of hippocampus tissue of the mice in various groups were observed by transmission electron microscope； Western blotting and immunohistochemistry methods were used to detect the expression levels of PI3K，AKT and mTOR proteins in hippocampus tissue of the mice in various groups.

Results

The Water Maze results showed that the escape latency time of mice in model group was significantly longer than that in control group （P<0.05）， and the escape latency of the mice in acupuncture group was significantly shorter than that in model group （P<0.05）. The transmission electron microscope observation results showed that the neurons in hippocampal region of the mice in model group appeared deformed， irregular or atrophied， and the nuclear membrane was rough and incomplete， the double-layer structure was fuzzy， and the intracellular phagocytosis was reduced； the neurons in the hippocampal region of the mice in acupuncture group still had some irregular deformation and the arophy and autophagic vesicles could be seen in the cytoplasm. The Western blotting and immunohistochemistry results showed that compared with control group， the expression levels of PI3K， AKT， and mTOR proteins in hippocampus tissue of the mice in model group were significantly increased （P<0.05）； compared with model group， the expression levels of PI3K， AKT， and mTOR proteins in hippocampus tissue of the mice in high dose of TCM group， acupuncture group，and acupuncture+ TCM group were decreased（P<0.05），especially in acupuncture+TCM group （P<0.05）.

Conclusion

The combination of acupuncture and medicine can improve the cognitive function of ApoE gene knockout mice， and its mechanism may be achieved by inhibiting the excessive activation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and promoting the autophagy in hippocampal cells.

Key words: acupuncture, traditional Chinese medicine, cognitive function, autophagy, phosphatidylinosital-3-kinase, protein kinase B, mamalian target of repamycin

中图分类号:

R224.2

吕美娟,马贤德,任路. 针药并用诱导自噬对ApoE基因敲除小鼠认知功能的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(6): 1124-1130.

Meijuan LU,Xiande MA,Lu REN. Effect of acupuncture combined with medicine-induced autophagy on cognitive function of mice with ApoE gene knockout[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2020, 46(6): 1124-1130.

图/表 5

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参考文献 27

1	TRAYKOV L， BAUDIC S， RAOUX N， et al. Patterns of memory impairment and perseverative behavior discriminate early Alzheimer's disease from subcortical vascular dementia［J］. J Neurol Sci， 2005， 229/230： 75-79.
2	MEGA M S， CUMMINGS J L， FIORELLO T， et al. The spectrum of behavioral changes in Alzheimer’s disease［J］. Neurology， 1996， 46（1）： 130-135.
3	XU F， MA J J， SUN F， et al. The efficacy of general practitioner assessment of cognition in Chinese elders aged 80 and older［J］. Am J Alzheimers Dis Other Demen， 2019， 34（7/8）： 523-529.
4	MAWUENYEGA K G， SIGURDSON W， OVOD V， et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer’s disease［J］. Science， 2010， 330（6012）： 1774.
5	WANG J， GU B J， MASTERS C L， et al. A systemic view of Alzheimer disease - insights from amyloid-β metabolism beyond the brain［J］. Nat Rev Neurol， 2017， 13（11）： 703.
6	MASTERS C L， BATEMAN R， BLENNOW K，et al.Alzheimer’s disease［J］.Nat Rev Dis Primers，2015，1（1）：15056.
7	MENZIES F M， FLEMING A， CARICASOLE A， et al. Autophagy and neurodegeneration： pathogenic mechanisms and therapeutic opportunities［J］. Neuron， 2017， 93（5）： 1015-1034.
8	UDDIN M S， STACHOWIAK A， MAMUN A A， et al. Autophagy and Alzheimer’s disease： from molecular mechanisms to therapeutic implications［J］. Front Aging Neurosci， 2018， 10： 4.
9	吴东南，刘玲，明淑萍，等. 基于“Aβ异常沉积”浅析中医“从痰论治”阿尔茨海默病［J］.中华中医药杂志， 2019， 34（10）： 4699-4702.
10	王春兰，陈泽林，李桂兰. 常用实验动物穴位的标准化定位方法研究［J］. 天津中医药， 2016， 33（2）： 100-103.
11	JANSEN D， ZERBI V， JANSSEN C I， et al. Impact of a multi-nutrient diet on cognition， brain metabolism， hemodynamics， and plasticity in apoE4 carrier and apoE knockout mice［J］. Brain Struct Funct， 2014， 219（5）： 1841-1868.
12	LIBBY P， LICHTMAN A H， HANSSON G K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis： from mice to humans［J］. Immunity， 2013， 38（6）： 1092-1104.
13	PIEDRAHITA J A， ZHANG S H， HAGAMAN J R， et al. Generation of mice carrying a mutant apolipoprotein E gene inactivated by gene targeting in embryonic stem cells［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1992， 89（10）： 4471-4475.
14	JANKOWSKY J L， ZHENG H. Practical considerations for choosing a mouse model of Alzheimer’s disease［J］. Mol Neurodegener， 2017， 12（1）： 89.
15	谢光霞. 督灸纠正痰湿体质肥胖者体质偏颇及对血脂、TNF-α影响的临床研究［J］. 光明中医， 2019， 34（16）： 2525-2528.
16	王陈芳，徐宇杰，夏文进，等. 泻浊调脂茶对痰浊型血脂异常病前状态的调脂效果观察［J］.中国乡村医药， 2019， 26（11）：31.
17	SKOOG I， GUSTAFSON D. Update on hypertension and Alzheimer’s disease［J］. Neurol Res， 2006， 28（6）： 605-611.
18	赵健邦. 从痰论治痴呆及石菖蒲对拟AD大鼠模型的作用及机制研究［D］. 武汉：湖北中医药大学， 2017.
19	张占军，王永炎. 肾虚-痰瘀-酿毒-病络—中医对老年性痴呆早期发病病机认识［J］. 中国中医基础医学杂志， 2015， 21（3）： 244-246.
20	BOLAND B， YU W H， CORTI O， et al. Promoting the clearance of neurotoxic proteins in neurodegenerative disorders of ageing［J］. Nat Rev Drug Discov， 2018， 17（9）： 660-688.
21	张宁，倪普，徐凌凡，等. ApoE基因敲除小鼠海马神经元内β淀粉样蛋白的表达变化［J］. 安徽医科大学学报， 2011， 46（6）： 531-534.
22	王晋平，唐农，刘布谷，等. 细胞自噬在老年性痴呆病理学中的作用探讨及其治疗［J］. 中华中医药学刊， 2016， 34（8）： 1900-1903.
23	CHANG L， GRAHAM P H， NI J， et al. Targeting PI₃K/Akt/mTOR signaling pathway in the treatment of prostate cancer radioresistance［J］. Crit Rev Oncol Hematol， 2015， 96（3）： 507-517.
24	LIN K N， JIANG Y L， ZHANG S G， et al. Grape seed proanthocyanidin extract reverses multidrug resistance in HL-60/ADR cells via inhibition of the PI₃K/Akt signaling pathway［J］. Biomed Pharmacother， 2020， 125： 109885.
25	SWIECH L， PERYCZ M， MALIK A， et al. Role of mTOR in physiology and pathology of the nervous system［J］. Biochim Biophys Acta， 2008， 1784（1）： 116-132.
26	HERAS-SANDOVAL D， PÉREZ-ROJAS J M， HERNÁNDEZ-DAMIÁN J， et al. The role of PI₃K/AKT/mTOR pathway in the modulation of autophagy and the clearance of protein aggregates in neurodegeneration［J］. Cell Signal， 2014， 26（12）： 2694-2701.
27	张利达，韩为，朱才丰，等. 艾灸督脉调控PI₃K/Akt/mTOR信号通路增强APP/PS1双转基因AD小鼠自噬水平的研究［J］. 中国针灸， 2019， 39（12）： 1313-1319.

[1]	汪文涛,米旭光,周阳,蒲文星,高佳旭,景猛,孟繁凯. 骨髓间充质干细胞来源外泌体诱导自噬对MPP⁺抑制SH-SY5Y细胞存活的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(3): 606-614.
[2]	李官虎,郎庆旭,刘纯岩,刘沁,耿梦柔,李晓倩,王珍琦. 丙戊酸联合X射线照射对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(3): 622-629.
[3]	马亚博,原筱潭,谢贤国,刘新峰,徐金瑞,杨易. 不同发育期小鼠卵巢组织中Wnt5a蛋白表达水平及其对卵母细胞自噬的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 277-283.
[4]	叶钰娟,张娟娟,马重兵,严兴科. 针刺干预对单眼视觉剥夺模型大鼠视皮层方位柱“漂移”和异常重组的调节作用及其脑功能机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 291-298.
[5]	董营,郭家女,王思懿,郭丹,王力可,温旭,刘立峰,曲萌,于春艳,刘楠楠,王丹,陈昌捷. 内质网应激PERK-eIF2α-ATF4信号通路在延缓APP/PS1小鼠移植瘤生长中的作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 324-330.
[6]	祁冰雪,王杨威,张艺献,赵静波,马彦,孙亚东. 利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾脏功能和足细胞损伤的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 331-339.
[7]	周阳,米旭光,蒲文星,汪文涛,景猛,孟繁凯. 褪黑素对过氧化氢诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化应激的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 340-347.
[8]	孙艳敏,胡俊攀,王冰玉,傅金英. 山姜素对来曲唑诱导的多囊卵巢综合征模型大鼠的治疗作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(1): 129-135.
[9]	孙文雄,李蒲. SOCS3在弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血单个核细胞中的表达及其对OCI-LY7细胞自噬和凋亡的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(1): 172-179.
[10]	周超锋,周世繁,田青,王赛,李洪霖,马纯政. lncRNA-NORAD表达对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(1): 33-43.
[11]	刘春旭,孙红霞,胡波,姜恩平. 北五味子乙素对大鼠心脏成纤维细胞增殖的抑制作用及其PI3K/Akt/P27kip1信号通路机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(1): 52-58.
[12]	徐小磊,杨玉琨,李忠明,李欣悦,王颖,盛杰,张晶,孙秀玲,王洪艳,曲莉,李环. 人参皂苷Rg3对邻苯二甲酸二丁酯致小鼠生殖功能损伤的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(6): 1429-1436.
[13]	马静静,刘宇,梁艳,李颖. 益母草总生物碱对药物流产大鼠蜕膜绒毛组织排出的促进作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(6): 1476-1484.
[14]	黄晓巍,刘玥欣,王晋冀,许佳明,唐秋竹,林贺,任吉祥,兰天野. 鹿茸多肽对轻度认知功能障碍大鼠学习记忆能力的改善作用及其调节Keap1/Nrf2 /HO-1信号通路的机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(5): 1215-1220.
[15]	王继凤,刘晓冉,隋欣,阚默,李辉,郭文军,杨擎,张壮,明思彤,李娜,曲晓波. 基于cAMP/PKA/CREB信号通路独参汤对衰老模型大鼠认知功能障碍的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(4): 865-873.