p38 MAPK抑制剂通过抑制NLRP3途径介导的细胞焦亡对小鼠慢性阻塞性肺疾病损伤的改善作用

doi:10.13481/j.1671-587X.20220324

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制剂SB303580（SB）对小鼠慢性阻塞性肺疾病（COPD）进展的影响，并阐明其可能的作用机制。

方法

将48只C57BL/6小鼠分为对照组、SB组、COPD组和COPD+SB组，每组12只。COPD组和COPD+SB组小鼠给予香烟烟雾和脂多糖（LPS）建立COPD模型。吸入乙酰甲胆碱（Mch）后观察各组小鼠气道阻力以评价各组小鼠肺功能，HE染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现，细胞计数法和ELISA法检测各组小鼠肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素18（IL-18）水平，体外应用烟草提取物（CSE）刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，将细胞分为对照组、SB组、CSE组和SB+CSE组。细胞免疫荧光染色观察各组巨噬细胞中NOD样受体蛋白3（NLRP3）及裂解型半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的表达，流式细胞术检测各组细胞焦亡率和早期凋亡率，Western blotting法检测各组小鼠肺组织和巨噬细胞中磷酸化p38（p-38）、焦亡相关蛋白和核因子κB（NF-κB）信号通路相关蛋白表达水平。

结果

成功构建COPD小鼠模型。与对照组比较，COPD组和COPD+SB组小鼠气道阻力，BALF中白细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数量及TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平以及肺组织中p-p-38、NLRP3、半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、NF-κB p65及Toll样受体4（TLR4）蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）；肺组织结构明显受损，气道上皮细胞脱落，部分相邻肺泡融合至肺大泡等病理学改变。与对照组比较，SB组小鼠气道阻力，BALF中白细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数及TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18水平和肺组织中NLRP3、caspase-1、ASC、NF-κB p65及TLR4蛋白表达水平均无明显改变（P>0.05）；肺组织结构正常，但肺组织中p-p-38蛋白表达水平降低（P<0.05）。与COPD组比较，COPD+SB组小鼠气道阻力，BALF中白细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数量及TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18水平和肺组织中NLRP3、caspase-1、ASC、NF-κB p65及TLR4蛋白表达水平均降低（P<0.05），肺组织病理损伤明显减轻。体外实验，与对照组比较，CSE组和CSE+SB组巨噬细胞中NLRP3和cleaved caspase-3的表达增多、细胞焦亡率、早期凋亡率及细胞中p-p-38、ASC、NF-κB p65、TLR4和cleaved caspas-3蛋白表达水平均升高（P<0.05或P<0.01）；SB组巨噬细胞的细胞焦亡率、早期凋亡率和细胞中NLRP3、cleaved caspase-3、ASC、NF-κB p65、TLR4及cleaved caspas-3蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05），但p-p-38蛋白表达水平降低（P<0.05）。与CSE组比较，CSE+SB组巨噬细胞的早期凋亡率和细胞中cleaved caspase-3表达水平明显升高（P<0.05），细胞焦亡率及细胞中p-p-38、NLRP3、ASC、NF-κB p65、TLR4及cleaved caspas-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。

结论

SB可能通过抑制NLRP3途径介导巨噬细胞焦亡，改善COPD肺损伤和炎症反应。

关键词: 慢性阻塞性肺疾病, p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB303580, 细胞焦亡, 细胞凋亡, 巨噬细胞

Abstract: Objective

To investigate the effect of p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK） inhibitor SB303580 （SB） on the progression of chronic obstructive pulmonary disease （COPD） in the mice， and to elucidate its possible mechanism.

Methods

A total of 48 C57BL/6 mice were divided into control group，SB group， COPD group， and COPD+SB group， and there were 12 mice in each group. The mice in COPD group and COPD+SB group were given cigarette smoke and lipopolysaccharide （LPS） to establish the COPD models. The airway resistance after inhalation of methacholine （Mch） was observed to evaluate the lung function of the mice in various groups， and the pathomophology of lung tissue of the mice in various groups was observed by HE staining. The total number of white blood cells， neutrophils， macrophages and lymphocytes， the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-18 （IL-18） in pulmonary alveolar lavage fluid （BALF） of the mice in various groups were detected by cell counting and ELISA method.The mouse macrophage RAW264.7 cells were stimulated by cigaritte smoke extract （CSE） in vitro， and the cells were divided into control group， SB group， CSE group and SB+CSE group. Cell immunofluorescence staining was used to observe the expressions of NOD-like receptor protein 3（NLRP3） and cleaved caspase-3 in the macrophages in various groups， and flow cytometry was used to detect the pyroptotic rates and early apoptotic rates of the cells in various groups，and Western blotting method was used to detect the expression levels of phosphorylated p-38（p-p-38），pyroptosis-related and nuclear factor κB（NF-κB） signaling pathway related poteins in the macrophages in various groups.

Results

The COPD mouse models were successfully established.Compared with control group， the airway resistance of the mice in COPD group and COPD+SB group， the total number of white blood cells， neutrophils， macrophages and lymphocytes in BALF， the levels of TNF-α， IL-6， IL-1β ，IL-18 in BALF， and the expression levels of p-p-38， NLRP3，cysteine protease 1（caspase-1），apoptosis-associated spotted protein（ASC），NF-κB p65，and Toll-like receptor 4 （TLR4） proteins in lung tissue of the mice were increased （P<0.05 or P<0.01）；the lung tissue was obviously damaged， the airway epithelial cells were exfoliated， and some adjacent alveoli fused to bullae.Compared with control group， the airway resistance of the mice in SB group， the total number of white blood cells， neutrophils， macrophages and lymphocytes in BALF， the levels of TNF-α， IL-6， IL-1β ，and IL-18 in BALF， and the expression levels of NLRP3， caspase-1， ASC， NF-κB p65， and TLR4 proteins in lung tissue had no significant differences（P>0.05）； the lung tissue was normal， but the expression level of p-p-38 in lung tissue was significantly decreased （P<0.05）. Compared with COPD group， the airway resistance of the mice in COPD+SB group， the total number of white blood cells， neutrophils， macrophages and lymphocytes in BALF， the levels of TNF-α， IL-6， IL-1β， and IL-18 in BALF， and the expression levels of NLRP3， caspase-1， ASC， NF-κB p65，and TLR4 proteins were decreased（P<0.05）；the pathological injury of lung tissue of the mice in COPD+SB group was alleviated（P<0.05）. In vitro experiments， compared with control group， the expression amounts of NLRP3 and cleaved caspase-3， pyroptotic rates and early apoptotic rates of the cells， the expression levels of p-p-38， ASC， NF-κB p65， TLR4， and cleaved caspas-3 proteins in the macrophages in CSE group and CSE+SB group were increased （P<0.05 or P<0.01）；the pyroptotic rate and early apoptotic rate of the cells， and expression levels of NLRP3， cleaved caspase-3， ASC， NF-κB p65， TLR4， and cleaved caspase-3 proteins in the macrophages in SB group had no significant differences（P>0.05）， and the expression level of p-p-38 in SB group was decreased （P<0.05）. Compared with CSE group， the early apoptotic rate of the macrophages and the expression level of cleaved caspase-3 in the cells in CSE+SB group were increased （P<0.05），and the pyroptotic rate， the expression levels of p-p-38， NLRP3， ASC， NF-κB p65，TLR4， and cleaved caspase-3 proteins were decreased （P<0.05）.

Conclusion

SB may improve the lung injury and inflammatory response of COPD by inhibiting the pyroptosis of macrophages mediated by the NLRP3 pathway.

Key words: Chronic obstructive pulmonary disease, P38 MAPK inhibitor SB303580, Cell pyroptosis, Apoptosis, Macrophages

中图分类号:

R563.13

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Group	No. of total leukocytes	No. of neutrophils	No. of macrophages	No. of lymphocytes
Control	7.41±1.35	2.79±0.33	3.51±0.48	5.66±1.49
SB	6.82±1.26	2.84±0.64	4.02±0.41	6.17±1.01
COPD	42.19±5.49^*	12.61±2.38^*	17.91±2.18^*	19.84±3.18^*
COPD+SB	17.11±3.02^*△	8.73±1.25^*△	12.58±1.26^*△	14.55±2.90^*△
F	36.106	19.187	31.439	28.215
P	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

Group	TNF-α	IL-6	IL-1β	IL-18
Control	82.16±15.09	77.41±13.33	14.51±4.28	20.03±3.05
SB	79.31±20.11	70.79±14.26	15.09±3.17	19.85±2.71
COPD	331.28±49.30^**	376.21±51.48^**	235.66±34.20^**	84.62±16.15^*
COPD+SB	259.17±32.85^*△	265.11±14.72^*△	91.83±27.57^**△△	62.05±11.42^*△
F	20.055	44.682	24.273	39.095
P	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

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