HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达

doi:10.13481/j.1671-587x.20170517

吉林大学学报(医学版) ›› 2017, Vol. 43 ›› Issue (05): 948-952.doi: 10.13481/j.1671-587x.20170517

HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达

田丹¹, 孙新¹, 安晓婷², 张立岩³, 刘杨¹, 佟海滨¹, 李坦¹, 申野¹, 满枋霖¹, 颜伟群⁴

1. 北华大学生命科学研究中心, 吉林吉林 132013;
2. 北京大学人民医院血液研究所骨髓移植病房, 北京 100044;
3. 北华大学附属医院骨外1科, 吉林吉林 132013;
4. 吉林大学药学院生物工程教研室, 吉林长春 130021

收稿日期:2017-04-27 出版日期:2017-09-28 发布日期:2017-09-29
通讯作者: 孙新,教授,硕士研究生导师(Tel:0432-64608351,E-mail:sunxinbh@126.com) E-mail:sunxinbh@126.com
作者简介:田丹(1979-),女,吉林省吉林市人,助理研究员,医学硕士,主要从事生物化学和分子生物学方面的研究。
基金资助:
吉林省教育厅"十二五"科学技术研究项目资助课题（吉教科合字[2014]第173号）；吉林省科技厅分子老年医学重点实验室项目资助课题（20130624003 JC）；吉林省吉林市科技计划项目资助课题（201437024，2015233007）

Construction and eukaryotic expression of recombinant HSA-TP5 fusion gene expression vector

TIAN Dan¹, SUN Xin¹, AN Xiaoting², ZHANG Liyan³, LIU Yang¹, TONG Haibin¹, LI Tan¹, SHEN Ye¹, MAN Fanglin¹, YAN Weiqun⁴

1. Life Science Research Center, Beihua University, Jilin 132013, China;
2. Institute of Hematology, People'sHospital, Beijing University, Beijing 100044, China;
3. First Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital, Beihua University, Jilin 132013, China;
4. Department of Bioengineering, School of Pharmacy, Jilin University, Changchun 130021, China

Received:2017-04-27 Online:2017-09-28 Published:2017-09-29

摘要/Abstract

摘要： 目的：构建人血清白蛋白（HSA）-胸腺五肽（TP5）融合蛋白表达载体，并在毕赤酵母中表达，阐明其生物学活性。方法：利用基因重组技术构建HSA-TP5融合基因，并转染至毕赤酵母中从而构建其真核表达体系，通过琼脂糖凝胶电泳分离及试剂盒纯化获得PPICZαC-HSA-TP5真核重组表达质粒；采用两步发酵法对HSA-TP5基因工程菌进行高密度发酵，对发酵液上清蛋白沉淀浓缩，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、阳离子交换层析及疏水层析等方法分离纯化蛋白；采用MTT法检测该融合蛋白促淋巴细胞增殖活性。结果：PCR法获得HSA目的基因片段长度为1 845 bp。酶切鉴定融合质粒HSA-TP5-pPICZαC得到片段长度为707 bp。测序分析，目的基因HSA和TP5序列与GenBank公布的基因序列完全一致，并正向连接融合。PCR法鉴定PPICZαC-HSA-TP5真核重组质粒与酵母基因组DNA整合，与对照组比较，转化组出现基因片段长度为1 860 bp。SDS-PAGE分析，在甲醇诱导后72 h内，随着诱导时间延长，HSA-TP5融合蛋白表达量逐步升高。利用阳离子交换层析及AKTA多功能蛋白纯化系统纯化得到HSA-TP5融合蛋白。MTT法检测，HSA-TP5融合蛋白与TP5蛋白具有一致的促淋巴细胞增殖活性。结论：通过构建HSA-TP5毕赤酵母真核表达体系可获得HSA-TP5融合蛋白并具有生物学活性。

关键词: 基因表达, 胸腺五肽, 人血清白蛋白, 融合基因

Abstract: Objective: To construct the expression vector of the fusion protein of human serum albumin (HSA) and thymopentin (TP5) and to express it in Pichia pastoris, and to elucidate the biological activity of fusion protein. Methods: The HSA-TP5 fusion gene was constructed by gene recombination and transfected into Pichia pastoris to construct the eukaryotic expression system of HSA-TP5. The recombinant eukaryotic expression plasmid of PPICZα -HSA-TP5 was obtained by agarose gel electrophoresis and purification reagent. The two step fermentation method was used to ferment gene engineering bacteria of HSA-TP5 in high density, and the fermentation supernatant protein was precipitated and concentrated; the purified fusion protein was obtained by cation exchange chromatography and hydrophobic chromatography and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The effect of the fusion protein on the proliferation of lymphocytes was detected by MTT assay. Results: The HSA target gene fragment with length of 1 845 bp was achieved by PCR method. The HSA-TP5-pPICZαC fusion plasmid was identified by restriction endonuclease digestion, and the fragment length was 707 bp. The sequence analysis showed that the HSA and TP5 sequences of the target genes were identical with the gene sequences reported in GenBank and were fused by forward fusion. PCR method confirmed that the eukaryotic recombinant plasmid PPICZ αC -HSA-TP5 was integrated into the yeast genome, and compared with control group, the target gene PCR product length was found to be 1 860 bp. SDS-PAGE analysis showed that the expression level of HSA-TP5 fusion protein was gradually increased with the induction time within 72 h. HSA-TP5 fusion protein was purified by cation exchange chromatography and AKTA multifunctional protein purification system.The MTT assay results showed that HSA-TP5 fusion protein was consistent with TP5 protein in promoting lymphocyte proliferation activity. Conclusion: HSA-TP5 fusion protein can be obtained by constructing the eukaryotic expression system of Pichia pastoris and owns the biological activity.

Key words: thymopentin, human serum albumin, fusion gene, gene expression

中图分类号:

Q786

田丹, 孙新, 安晓婷, 张立岩, 刘杨, 佟海滨, 李坦, 申野, 满枋霖, 颜伟群. HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(05): 948-952.

TIAN Dan, SUN Xin, AN Xiaoting, ZHANG Liyan, LIU Yang, TONG Haibin, LI Tan, SHEN Ye, MAN Fanglin, YAN Weiqun. Construction and eukaryotic expression of recombinant HSA-TP5 fusion gene expression vector[J]. Journal of Jilin University Medicine Edition, 2017, 43(05): 948-952.

参考文献

[1] Schlesinger DH,Goldstein G.The amino acid sequence of thymopoietin Ⅱ[J].Cell,1975, 5(4):361-365.
[2] Cascinelli N,Clemente C,Bufalino R,et al.Perinodular injection of thymopentin(TP5)in cutaneous and subcutaneous metastases of melanoma[J]. Melanoma Res,1993, 3(6):471-476.
[3] 何文杰,涂长玲,江波. 胸腺五肽对老年晚期非小细胞肺癌患者免疫功能的影响研究[J].实用心脑肺血管病杂志,2015,23(7):72-74.
[4] 王兴玲,于明新. 苦参碱联合胸腺五肽对卵巢癌腹腔热化疗大鼠免疫功能的影响[J].实用药物与临床,2017,20(1):4-8.
[5] 金高娃,秦迎春,葛永利,等. 胸腺五肽联合化疗治疗肺癌患者效果及对血清、呼气冷凝液ET-1和血清T淋巴细胞亚群水平的影响[J]. 疑难病杂志,2016,15(9):896-899.
[6] 耿书军,刘建玲,冯玉英,等. 胸腺五肽联合常规抗结核方案治疗复治菌阳肺结核的疗效及对患者免疫功能的影响[J]. 中国现代医学杂志,2015,25(7):51-53.
[7] 谢婧,张长平,王咏梅.胸腺五肽辅助用药的临床有效性循证评价[J].中国新药杂志,2015,24(22):2599-2605.
[8] 刘文慧,吴敏,沈其,等. 人血清白蛋白融合技术研究进展[J]. 药学进展,2015,39(3):199-203.
[9] 张伟,代晓朋,王鲁燕,等. 重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价[J]. 中国药理学与毒理学杂志,2014,28(4):550-555.
[10] 富岩,杨小楠,魏开华,等. 具创新分子结构的更优长效性重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的表达、制备和特性研究[J]. 中国医药生物技术,2017,12(1):6-18.
[11] 李成媛,张晶晶,钱凯,等. 人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达[J]. 中国生物工程杂志,2016,36(7):7-14.
[12] 杨刚刚,马诚凯,史世会,等. 豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定[J]. 生物技术通报,2015,31(10):222-229.
[13] 马义,赵绍军,洪岸. 新型人血清白蛋白特异结合肽ML的筛选及鉴定[J]. 中国生物工程杂志,2015,35(5):74-80.
[14] 陈通威,杜莹莹,薛冲,等. 注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白生物学活性检测方法学研究[J]. 山西医药杂志,2014,43(5):499-501.
[15] 王芙蓉,杜艳涛,刘海雄. 人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造中的应用[J]. 生命科学,2015,27(9):1197-1205.
[16] 李伟,胡红梅,陈彩芬,等.Notch配体Delta-1基因真核表达载体的构建[J]. 中国老年学杂志,2015,35(11):2898-2900.
[17] 李伟,胡红梅,陈彩芬,等.重组pcDNA3.1-HEGF基因真核表达载体的构建[J].中国老年学杂志,2015,35(14):3807-3809.

HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达

Construction and eukaryotic expression of recombinant HSA-TP5 fusion gene expression vector

RichHTML

PDF (PC)

赞

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

Metrics

本文评价

推荐阅读 0

[1]	陈炳鹏, 任明, 李容杭, 韩青, 王金成. 基因芯片技术检测NOB1对骨肉瘤细胞相关基因的调控作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(05): 929-934.
[2]	辛桂杰, 朱海超, 李昊, 温剑平. 最低限度免疫定义基因表达的HCV多表位DNA疫苗对小鼠细胞免疫的诱导作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1071-1075.
[3]	朱伟, 黎桂仙, 陈洪浪, 尹金宝, 姜恩平. CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV⁺肿瘤细胞增殖和凋亡的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(03): 424-429.
[4]	齐玲, 王玮瑶, 郑中华, 张以忠, 赵丽微, 钟秀宏, 赵东海, 杨淑艳, 杨宁江, 任旷, 于洪泉. SUMO及SUMO化修饰蛋白在恶性胶质瘤发生中的作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 7-10.
[5]	刘姝，王霁雪,吴雅臻，王淑梅. 色素上皮源性因子基因转染对巨噬细胞诱导大鼠增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(6): 1181-1185.
[6]	孙晓宇，何钟勤，刘晓红，高心，钟丞，薛莹. 殊异韦荣菌sahH基因的克隆、表达和纯化[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(4): 704-709.
[7]	张雪，陈萍，毕云枫，曲宁宁，刘琼，孙鑫泽. 木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因的克隆与表达[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(4): 690-693.
[8]	贾晓辉，罗建民，刘亚平，尹婉宜，张丽红. SHIP和Caspase-3 mRNA在骨髓增生异常综合征患者骨髓组织中的表达及其临床意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 554-558.
[9]	贺梦子，赵银龙，刘晓冬，马淑梅，刘欣. 甲状腺乳头状癌组织中差异表达miRNA及其靶基因的筛选和预测[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(1): 99-103.
[10]	段秀梅\|邹亚斌\|马洪喜\|李树蕾\|王银萍\|王超\|李玉琴. 结核杆菌热休克蛋白70刺激表位在融合基因疫苗中的佐剂作用[J]. J4, 2012, 38(3): 506-511.
[11]	伍贤军\|缪璇\|程秀\|王妍青\|辻一郎\|李晓萌. GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位[J]. J4, 2011, 37(6): 1024-1027.
[12]	孙玲,刘慧颖,李淑红\|宫鹏涛\|张西臣. 弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达[J]. J4, 2011, 37(4): 631-635.
[13]	刘洁, 贾天军, 刘雪晴, 贾晓辉, 翟雪琼. 人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2 C端基因的克隆与鉴定[J]. J4, 2011, 37(1): 51-55.
[14]	赵丽晶, 许多, 程宏, 梁作文, 鲁育铭, 韩向北, 郭亚雄, 赵丽娟, 董妍. 20(s)-原人参二醇对体外培养Siha细胞caspase-3表达激活的影响[J]. J4, 2011, 37(1): 26-29.
[15]	李智, 郎晓讴, 张绍军, 姜文华. Stat3和Stat5在分化型甲状腺癌组织中的表达及意义[J]. J4, 2010, 36(4): 708-712.