吉林大学学报(医学版) ›› 2017, Vol. 43 ›› Issue (05): 948-952.doi: 10.13481/j.1671-587x.20170517
田丹1, 孙新1, 安晓婷2, 张立岩3, 刘杨1, 佟海滨1, 李坦1, 申野1, 满枋霖1, 颜伟群4
TIAN Dan1, SUN Xin1, AN Xiaoting2, ZHANG Liyan3, LIU Yang1, TONG Haibin1, LI Tan1, SHEN Ye1, MAN Fanglin1, YAN Weiqun4
摘要: 目的:构建人血清白蛋白(HSA)-胸腺五肽(TP5)融合蛋白表达载体,并在毕赤酵母中表达,阐明其生物学活性。方法:利用基因重组技术构建HSA-TP5融合基因,并转染至毕赤酵母中从而构建其真核表达体系,通过琼脂糖凝胶电泳分离及试剂盒纯化获得PPICZαC-HSA-TP5真核重组表达质粒;采用两步发酵法对HSA-TP5基因工程菌进行高密度发酵,对发酵液上清蛋白沉淀浓缩,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、阳离子交换层析及疏水层析等方法分离纯化蛋白;采用MTT法检测该融合蛋白促淋巴细胞增殖活性。结果:PCR法获得HSA目的基因片段长度为1 845 bp。酶切鉴定融合质粒HSA-TP5-pPICZαC得到片段长度为707 bp。测序分析,目的基因HSA和TP5序列与GenBank公布的基因序列完全一致,并正向连接融合。PCR法鉴定PPICZαC-HSA-TP5真核重组质粒与酵母基因组DNA整合,与对照组比较,转化组出现基因片段长度为1 860 bp。SDS-PAGE分析,在甲醇诱导后72 h内,随着诱导时间延长,HSA-TP5融合蛋白表达量逐步升高。利用阳离子交换层析及AKTA多功能蛋白纯化系统纯化得到HSA-TP5融合蛋白。MTT法检测,HSA-TP5融合蛋白与TP5蛋白具有一致的促淋巴细胞增殖活性。结论:通过构建HSA-TP5毕赤酵母真核表达体系可获得HSA-TP5融合蛋白并具有生物学活性。
中图分类号: