检测水痘-带状疱疹病毒糖蛋白水平双抗体夹心ELISA法的建立和验证

doi:10.13481/j.1671-587x.20200633

吉林大学学报(医学版) ›› 2020, Vol. 46 ›› Issue (6): 1315-1323.doi: 10.13481/j.1671-587x.20200633

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检测水痘-带状疱疹病毒糖蛋白水平双抗体夹心ELISA法的建立和验证

朱琨莹¹,郭世杰²,袁若森³,潘东³,张春³,陈晓旭³,衣延明³,杨阳³,郑柏松¹(),姜春来⁴()

^1.吉林大学第一医院艾滋病与病毒研究所，吉林长春 130021
^2.吉林大学第一医院新生儿科，吉林长春 130021
^3.长春百克生物科技股份公司，吉林长春 130012
^4.吉林大学生命科学学院微生物免疫系，吉林长春 130012

收稿日期:2020-05-19 出版日期:2020-11-28 发布日期:2022-08-24
通讯作者: 郑柏松,姜春来 E-mail:zhengbs@jlu.edu.cn;jiangcl@jlu.edu.cn
作者简介:朱琨莹(1988－)，女，吉林省长春市人，在读医学硕士，主要从事生物化学与分子生物学方面的研究。
基金资助:
科技部国家科技重大专项基金资助课题(2018ZX10302104-001-010);吉林省卫健委科研项目资助课题(20161J065);吉林省分子病毒学重点实验室科研项目资助课题(20102209)

Establishment and validation of double antibody sandwich ELISA for determination of varicella zoster virus glycoprotein level

Kunying ZHU¹,Shijie GUO²,Ruosen YUAN³,Dong PAN³,Chun ZHANG³,Xiaoxu CHEN³,Yanming YI³,Yang YANG³,Baisong ZHENG¹(),Chunlai JIANG⁴()

^1.Institute of AIDS and Virology Research，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China
^2.Department of Neonatology，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China
^3.Changchun Baike Biotechnology Co. LTD，Changchun 130012，China
^4.Department of Microbial Immunology，School of Life Science，Jilin University，Changchun 130012，China

Received:2020-05-19 Online:2020-11-28 Published:2022-08-24
Contact: Baisong ZHENG,Chunlai JIANG E-mail:zhengbs@jlu.edu.cn;jiangcl@jlu.edu.cn

摘要/Abstract

摘要： 目的

建立可快速检测水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白抗原水平的双抗体夹心ELISA法，并验证其特异性、线性、准确性和精密性。

方法

采用抗VZV糖蛋白基因工程抗体建立双抗体夹心ELISA法，检测VZV糖蛋白抗原水平。优化抗体组合、抗体工作浓度、包被条件、封闭条件、酶标抗体反应条件和显色条件，并对建立的方法进行特异性、线性、准确性及精密性验证。

结果

捕获抗体VZV-mAb-03和酶标抗体VZV-mAb-HRP-02的组合为最优双抗组合，其最适浓度分别为450.0和0.1 μg·L^－1，最适包被条件为0.05 mol·L^－1 Tris-HCl（pH值为8.7±0.1）在4℃条件下包被过夜（18 h），最适封闭条件为1%牛血清白蛋白（BSA）在37 ℃条件下封闭2 h，最适样品稀释液为磷酸盐吐温缓冲液（PBST），抗原夹心与酶标抗体最适反应条件均为37 ℃、1 h，最适显色条件为37 ℃、15 min。经验证，该方法与其他人用疫苗及辅料成分无交叉反应；线性范围为500~2 600 PFU·mL^－1，回归系数（R²）> 0.95；批内回收率82.2%~115.7%，变异系数（CV）<10.2%；批间回收率80.5%~118.6%，板内CV<17.4%，板间CV<14.9%。

结论

建立了一种基于检测双抗体夹心的VZV糖蛋白抗原水平的ELISA检测方法，符合定量检测需要，可用于 VZV 疫苗的研发和生产过程中的抗原水平检测。

关键词: 水痘-带状疱疹病毒, 糖蛋白, 双抗体夹心, 酶联免疫吸附试验, 变异系数

Abstract: Objective

To establish a double antibody sandwich ELISA for rapid determination of varicella zoster virus（VZV） glycoprotein level， and to validate its specificity， linearity， accuracy， and precision.

Methods

Double antibody sandwich ELISA was established with the recombinant antibodies against VZV glycoprotein and used for the determination of VZV glycoprotein level. The antibody combination， antibody concentration， coating conditions， blocking conditions， enzyme-labled antibody reaction conditions，and chromogenic condition were optimizated in the experiment， and the established method was validated for the specificity， linearity， accuracy， and precision.

Results

The optimal combination of the double antibody was the group of VZV-mAb-03 as the capture antibody at a concentration of 450.0 μg·L^－1 and VZV-mAb-HRP-02 as the enzyme-labeled antibody at a concentration of 0.1 μg·L^－1； the optimal buffer for antibody coating was 0.05 mol·L^－1 Tris-HCl（pH=8.7±0.1），while the optimal temperature and time for coating were 4 ℃ and overnight（18 h） respectively； the bovine serum albumin（BSA） at a concentration of 1% was served as the blocking agent， while the optimal temperature and time for blocking were 37 ℃ and 2 h， respectively； the optimal reaction time of VZV and enzyme-labeled second antibody with PBST were both 1 h at the temperature of 37 ℃， and the optimal temperature and time for color reaction were 37 ℃ and 15 min， respectively. It was proved that this method had no cross reactions with the other vaccines or ingredients. The quantitation scope was 500－2 600 PFU·mL^－1， regression coefficient（R²）> 0.95； the in-batch recovery rate was 82.2%－115.7% ， and the in-batch coefficient of variable（CV）< 10.2%； the batch-to-batch recovery was 80.5%－118.6%， the CV in validation for inplate<17.4% and the CV inter-plate precisions<14.9%.

Conclusion

Double antibody sandwich ELISA suitable for determination of VZV glycoprotein level is established，which meets the requirements for quantitative determination， and might be used to determine the VZV antigen level during the development and production of VZV vaccine.

Key words: varicella zoster virus, glycoprotein, double antibody sandwich, enzyme linked immunosorbent assay, coefficient of variation

中图分类号:

R373.9

朱琨莹,郭世杰,袁若森,潘东,张春,陈晓旭,衣延明,杨阳,郑柏松,姜春来. 检测水痘-带状疱疹病毒糖蛋白水平双抗体夹心ELISA法的建立和验证[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(6): 1315-1323.

Kunying ZHU,Shijie GUO,Ruosen YUAN,Dong PAN,Chun ZHANG,Xiaoxu CHEN,Yanming YI,Yang YANG,Baisong ZHENG,Chunlai JIANG. Establishment and validation of double antibody sandwich ELISA for determination of varicella zoster virus glycoprotein level[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2020, 46(6): 1315-1323.

图/表 13

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参考文献 21

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Enzyme?labeled antibody	P/N ratio
Enzyme?labeled antibody	VZV?mAb?01	VZV?mAb?02	VZV?mAb?03	VZV?mAb?04	VZV?mAb?05
VZV-mAb-HRP-01	1.8	1.3	1.3	1.7	2.6
VZV-mAb-HRP-02	1.2	1.1	5.9	1.2	1.0
VZV-mAb-HRP-03	1.4	1.1	1.3	1.4	1.2

VZV?mAb?HRP-02	A(450) value
VZV?mAb?HRP-02	1∶2 500	1∶5 000	1∶7 500	1∶10 000
1∶2 000（P）	2.714±0.012	2.510±0.017	2.137±0.006	1.842±0.003
1∶2 000（N）	0.126±0.004	0.114±0.004	0.102±0.005	0.096±0.004
1∶4 000（P）	1.913±0.002	1.613±0.008	1.305±0.015	0.578±0.004
1∶4 000（N）	0.082±0.006	0.075±0.004	0.082±0.005	0.064±0.004
1∶6 000（P）	1.673±0.006	1.155±0.004	1.059±0.008	0.479±0.004
1∶6 000（N）	0.066±0.003	0.062±0.004	0.064±0.002	0.053±0.001
1∶8 000（P）	1.230±0.005	0.915±0.011	0.756±0.007	0.406±0.004
1∶8 000（N）	0.063±0.002	0.064±0.005	0.069±0.004	0.067±0.004

Coating condition	Positive A(450) value	Negative A(450) value	P/N ratio
4 ℃,overnight（18 h）	2.131	0.085	25.07
37 ℃,1 h	1.795	0.078	23.02
37 ℃,2 h	1.682	0.089	18.90
37 ℃,3 h	1.516	0.091	16.66

Blocking solution	37 ℃,1 h			37 ℃，2 h
Blocking solution	Positive A(450) value	Negative A(450) value	P/N ratio	Positive A(450) value	Negative A(450) value	P/N ratio
1%BSA	0.763±0.044	0.135±0.008	5.63	1.145±0.001	0.111±0.014	10.32
3%BSA	0.582±0.020	0.111±0.004	5.22	0.915±0.002	0.102±0.002	8.97
5% Nonfat dry milk	0.332±0.016	0.080±0.014	4.14	0.465±0.001	0.066±0.010	6.99
10% Newborn bovine serum	0.438±0.015	0.052±0.002	8.42	0.526±0.002	0.058±0.001	9.00

Chromogenic time	Positive A（450） value	P difference between adjacent 5 min	Negative A（450） value	N difference between adjacent 5 min	P/N ratio	P/N difference between adjacent 5 min
5 min	1.071 5	0.497	0.068 5	0.005	15.64	99.4
10 min	1.568 5	0.374	0.073 5	0.014	21.34	26.7
15 min	1.942 5	0.324	0.087 0	0.008	22.33	40.5
20 min	2.266 5	0.255	0.095 5	0.006	23.73	42.5
25 min	2.522 0	0.187	0.101 5	0.025	24.85	7.5
30 min	2.709 0	—	0.127 0	—	21.33	—
“－”No data.

检测水痘-带状疱疹病毒糖蛋白水平双抗体夹心ELISA法的建立和验证

Establishment and validation of double antibody sandwich ELISA for determination of varicella zoster virus glycoprotein level

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Theoretical titer （PFU·mL^-1）	Recovery rate （η/%）	CV （η/%）	Recovery rate （η/%）	CV （η/%）	Recovery rate（η/%）	CV （η/%）
506	89.2	10.2	95.3	4.4	98.3	5.5
1 013	104.7	4.1	100.8	1.5	102.8	5.0
1 520	115.7	3.1	100.9	3.8	101.8	3.5
2 027	112.0	6.5	106.4	3.5	116.8	1.1
2 534	82.2	7.8	93.0	3.4	88.0	4.3
Average value	100.7±13.0	5.4±1.9	99.3±4.7	3.1±0.9	101.5±9.3	3.5±1.5

Theoretical titer（PFU·mL^-1）	Inplate（n=8）（η/%）										Inter?plate（n=3）
	Test 1			Test 2				Test 3			Inter?plate（n=3）
	CV（η/%）		Recovery rate（η/%）		CV（η/%）		Recovery rate（η/%）	CV（η/%）		Recovery rate（η/%）	CV（η/%）		Recovery rate（η/%）
506	6.1	85.5		4.8		91.9		8.0	95.9		4.7	91.1
1 013	6.5	85.6		6.6		106.4		6.6	102.4		9.2	98.2
1 520	10.1	84.9		4.2		115.6		6.8	106.7		12.6	102.4
2 027	12.3	90.1		11.1		118.6		6.8	116.9		12.1	108.5
2 534	15.4	80.5		17.4		81.7		11.2	109.8		14.9	90.6
Average value	10.0±3.5	85.3±3.0		8.8±4.9		102.8±14.0		7.9±1.7	106.3±7.0		10.7±3.5	98.2±6.8

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