褪黑素对过氧化氢诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化应激的改善作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20220210

摘要/Abstract

摘要： 目的

研究褪黑素对过氧化氢（H₂O₂）诱导的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）氧化应激损伤的保护作用，并探讨其作用机制。

方法

体外培养SH-SY5Y细胞，将SH-SY5Y细胞分为对照组、H₂O₂组、不同浓度褪黑素组和2-苯基-N-乙酰色胺（Luzindole）组。对照组为正常培养SH-SY5Y细胞，H₂O₂组加入含有200 μmol·L^－1 H₂O₂的培养基，不同浓度褪黑素组加入不同浓度（1、5和10 μmol·L^－1）褪黑素和含有200 μmol·L^－1 H₂O₂的培养基，Luzindole组加入50 μmol·L^－1 Luzindole、10 μmol·L^－1褪黑素和含有200 μmol·L^－1 H₂O₂的培养基。采用CCK-8法检测各组SH-SY5Y细胞存活率，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，DCFH-DA荧光探针检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，Western blotting法检测各组细胞中微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）蛋白表达水平，荧光显微镜观察各组自噬泡荧光强度。

结果

与对照组比较，H₂O₂组SH-SY5Y细胞存活率降低（P<0.01），ROS水平和细胞凋亡率升高（P<0.01）。与H₂O₂组比较，不同浓度褪黑素组SH-SY5Y细胞存活率升高（P<0.05），ROS水平和细胞凋亡率降低（P<0.01），LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显升高（P<0.01），10 μmol·L^－1褪黑素组自噬泡荧光强度升高（P<0.05）。与10 μmol·L^－1褪黑素组比较，1 μmol·L^－1褪黑素组和Luzindole组SH-SY5Y细胞存活率明显降低（P<0.05）；1和5 μmol·L^－1褪黑素组及Luzindole组SH-SY5Y细胞中ROS水平和细胞凋亡率升高（P<0.05），SH-SY5Y细胞中LC3-Ⅱ表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）；1 μmol·L^－1褪黑素组和Luzindole组自噬泡荧光强度降低（P<0.05）。

结论

褪黑素可以抑制H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤，具有神经保护作用，其机制可能与降低ROS水平和提高细胞自噬有关。

关键词: 神经母细胞瘤细胞, 褪黑素, 氧化应激, 活性氧, 自噬

Abstract: Objective

To investigate the protective effect of melatonin on the hydrogen peroxide（H₂O₂）-induced oxidative stress injury of human neuroblastoma SH-SY5Y cells， and to explore its mechanism.

Methods

The SH-SY5Y cells were cultured in vitro and divided into control group，H₂O₂ group， melatonin groups， and N-acetyl-2-benzyltryptamine（Luzindole） group. The medium containing 200 μmol·L^－1 H₂O₂ was added in H₂O₂ group；different concentrations （1， 5 and 10 μmol·L^－1） of melatonin and medium containing 200 μmol·L^－1 H₂O₂ were added in melatonin groups； 50 μmol·L^－1 Luzindole， 10 μmol·L^－1 melatonin and the medium containing 200 μmol·L^－1 H₂O₂ were added in Luzindole group. The survival rates of human neuroblastoma SH-SY5Y cells were measured by CCK-8 method， the apoptotic rates of SH-SY5Y cells in various groups were detected by flow cytometry， and DCFH-DA fluorescence probe was used to detect the levels of reactive oxygen species（ROS） in the cells in various groups. The expression levels of microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）protein in the cells in various groups were detected by Western blotting method， and the fluorescence intensities of autophagic vesicles in various groups were observed by fluorescence microscope.

Results

Compared with control group， the survival rate of SH-SY5Y cells in H₂O₂ group was decreased （P<0.01），the ROS level and the apoptotic rate were increased （P<0.01）. Compared with H₂O₂ group， the survival rates of SH-SY5Y cells in different concentrations of melatonin groups were increased（P<0.05），the ROS levels and the apoptotic rates were significantly decreased （P<0.01），the LC3-Ⅱ protein expression levels were significantly increased （P<0.01）， and the fluorescence intensity of autophagic vesicles in 10 μmol·L^－1 melatonin group was increased（P<0.05）. Compared with 10 μmol·L^－１ melatonin group， the survival rates of SH-SY5Y cells in 1 μmol·L^－１ melatonin group and Luzindole group were significantly decreased（P<0.05）；the ROS levels and the apoptotic rates in the SH-SY5Y cells in 1 and 5 μmol·L^－1 melatonin groups and Luzindole group were significantly increased（P<0.05），and the LC3-Ⅱ protein expression levels in the SH-SY5Y cells were decreased（P<0.05 or （P<0.01）， and the fluorescence intensities of autophagic vessicles in the SH-SY5Y cells in 1 μmol·L^－1 melatonin group and Luzindole group were significantly decreased （P<0.05）.

Conclusion

Melatonin can inhibit the H₂O₂-induced oxidative stress injury of SH-SY5Y cells and has a neuroprotective effect，and its mechanism may be related to reducing the ROS levels and enhancing the autophagy of cells.

Key words: SH-SY5Y, Melatonin, Oxidative stress, Reactive oxygen species, Autophagy

中图分类号:

R741

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图/表 8

表1

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表2

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表4

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Group	Survival rate
Control	100.00±2.85
H₂O₂	54.64±5.85^*
Melatonin
1 μmol·L^－1	61.32±4.28^△#
5 μmol·L^－1	65.93±1.10^△
10 μmol·L^－1	67.72±2.29^△
Luzindole	57.72±2.48^△#

Group	ROS level
Control	1.80±0.54
H₂O₂	75.37±5.87^*
Melatonin
1 μmol·L^－1	66.19±0.68^△△#
5 μmol·L^－1	57.50±0.71^△△#
10 μmol·L^－1	52.50±2.17^△△
Luzindole	62.33±2.20^△##

Group	Apoptotic rate
Control	2.84±0.69
H₂O₂	50.85±1.69^*
Melatonin
1 μmol·L^－１	47.13±1.29^△#
5 μmol·L^－１	46.34±1.31^△#
10 μmol·L^－１	32.52±1.66^△△
Luzindole	43.02±2.40^△△#

Group	Fluorescence intensity
Control	1.00±0.18
H₂O₂	1.67±0.27^*
Melatonin
1 μmol·L^－1	1.91±0.24^*#
5 μmol·L^－1	2.46±0.51^*
10 μmol·L^－1	2.69±0.43^△
Luzindole	1.89±0.21^#

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