指环蛋白31对表皮生长因子受体表达的调控作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20230103

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨指环蛋白31（RNF31）对表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响，并分析RNF31对EGFR的调控机制。方法采用免疫共沉淀（Co-IP）法验证RNF31蛋白与EGFR蛋白的相互作用。HEK293T细胞分为空载体组（转染pcDNA3.1空载体）和RNF31组（转染RNF31-Flag质粒），采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和Western blotting法检测细胞中EGFR mRNA和蛋白表达水平。RNF31的泛素连接酶功能位点（RNF31^C699/702S）和去泛素化酶结合位点（RNF31^{N84A Y93A}）突变后，采用Western blotting法检测各组细胞中EGFR蛋白表达水平。HEK293细胞分为空载体组、RNF31组（转染RNF31-Flag质粒）、RNF31+EGFR抑制剂吉非替尼（Gefitinib）组和RNF31+EGFR抑制剂厄洛替尼（Erlotinib）组，采用Western blotting法检测各组细胞中EGFR及其下游信号通路蛋白表达水平。结果 Co-IP 法检测，RNF31蛋白与EGFR蛋白存在相互作用。与空载体组比较，RNF31组细胞中EGFR mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。与空载体组比较，转染RNF31^C699/702S组和野生型RNF31组细胞中EGFR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与RNF31组比较，转染RNF31^{N84A Y93A}组细胞中EGFR蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与空载体组比较，RNF31组细胞中EGFR及其下游信号通路中核因子κB（NF-κB）、磷酸化信号传导与转录激活因子3（p-STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸化MAPK（p-MAPK）蛋白表达水平明显升高（P<0.05），RNF31+Gefitinib组和RNF31+Erlotinib组细胞中蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、STAT3和MAPK蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 RNF31通过去泛素化酶结合结构域发挥去泛素化的作用，降低EGFR蛋白分子表面的泛素化水平，使EGFR蛋白降解速率减慢，同时高表达的EGFR可以激活其下游与细胞增殖和分裂相关蛋白的表达。

关键词: 指环蛋白31, 表皮生长因子受体, 泛素化, 蛋白互作, 去泛素化酶

Abstract:

Objective To investigate the effect of ring finger protein 31 （RNF31） on the expression of epidermal growth factor receptor （EGFR）， and to explore the regulation mechanism of RNF31 on EGFR. Methods The interaction between RNF31 and EGFR proteins was validated by co-immunoprecipitation （Co-IP） method.The HEK293T cells were divided into empty vector group（transfcted with pcDNA3.1 emptey vector）and RNF31 group（transfected with RNF31-Flag plasmid）. The expression levels of EGFR mRNA and protein in the cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blotting methods.After mutation of the ubiquitin ligase function of RNF31 （RNF31^C699/702S）and deubiquitinase binding site （RNF31^{N84A Y93A}），Western blotting method was used to detect the expression levels of EGFR protein in the cells in various groups.The HEK293T cells were divided into empty vector group，RNF31 group（transfected RNF31-Flag plasmid），RNF31+EGFR inhibitor Ggfitinib（Gefitinib） group and RNF31+EGFR inhibitor Erlotinib（Erlotinib） group； the expression levels of EGFR and its downstream sigaling pathway proteins in the cells in various groups were detected by Western blotting method. Results The Co-IP method detection results confirmed that the RNF31 was interacted with EGFR. Compared with empty vector group， the expression level of EGFR mRNA in the cells in RNF31 group was significantly decreased （P<0.05）. Compared with empty vector group， the expression levels of EGFR protein in the cells in RNF31^C699/702S group and wild-type RNF31 group were significantly increased（P<0.05）. Compared with RNF31 group，the expression level of EGFR protein in the cells in transfection RNF31^{N84A Y93A}group was decreased （P<0.05）. Compared with empty vector group，the expression levels of EGFR and nuclear transcription factor-κB（NF-κB）， phosphorylated signal transducer and activiator of transcription 3（p-STAT3），mitogen-activated protein kinase（MAPK） and phosporylated MAPK（p-MAPK） proteins in its downstream signling pathways in the cells in RNF31 group were significantly increased（P<0.05）；the expression levels of protein kinase B（Akt），phosphorylated Akt（p-Akt），STAT3 and MAPK proteins in the cells in RNF31+Gefitinib group and RNF31+Erlotinib group were significantly decreased（P<0.05）. Conclusion RNF31 exerts deubiquitinating through the deubiquitinase enzyme-binding struatural domain， reduces the ubiquitination level of the EGFR protein molecule surface， and slows down the degradation rate of EGFR protein， while highly expressed EGFR can activate the expressions of its downstream proteins related to cell proliferation and division.

Key words: Ring finger protein 31, Epidermal growth factor receptor, Ubiquitination, Protein interaction, Deubiquitinase

中图分类号:

薛富强,苏荣健,贺武斌,宋慧娟,栾治东. 指环蛋白31对表皮生长因子受体表达的调控作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2023, 49(1): 15-21.

Fuqiang XUE,Rongjian SU,Wubin HE,Huijuan SONG,Zhidong LUAN. Regulatory effect of ring finger protein 31 on expression of epidermal growth factor receptor and its mechanism[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2023, 49(1): 15-21.

图/表 7

表1

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参考文献 27

1	ROBICHAUX J P， LE X N， VIJAYAN R S K， et al. Structure-based classification predicts drug response in EGFR-mutant NSCLC［J］. Nature， 2021， 597（7878）： 732-737.
2	KOHNO T， MATSUI T， ENATSU S. Differences between EGFR exon 19 deletion and exon 21 L858R point mutation， frequently detected EGFR mutations in patients with non-small cell lung cancer， from a molecular biology viewpoint［J］. Gan To Kagaku Ryoho， 2021， 48（12）： 1463-1467.
3	SIGISMUND S， AVANZATO D， LANZETTI L. Emerging functions of the EGFR in cancer［J］. Mol Oncol， 2018， 12（1）： 3-20.
4	NGUYEN P V， ALLARD-VANNIER E， CHOURPA I，et al. Nanomedicines functionalized with anti-EGFR ligands for active targeting in cancer therapy： biological strategy， design and quality control［J］. Int J Pharm， 2021， 605： 120795.
5	URIBE M L， MARROCCO I， YARDEN Y. EGFR in cancer： signaling mechanisms， drugs， and acquired resistance［J］. Cancers， 2021， 13（11）： 2748.
6	LEE Y J， HO S R， GRAVES J D， et al. CGRRF1， a growth suppressor， regulates EGFR ubiquitination in breast cancer［J］. Breast Cancer Res， 2019， 21（1）： 134.
7	VAUGHAN R M， KUPAI A， ROTHBART S B. Chromatin regulation through ubiquitin and ubiquitin-like histone modifications［J］. Trends Biochem Sci， 2021， 46（4）： 258-269.
8	DAMGAARD R B. The ubiquitin system： from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities［J］.Cell Death Differ，2021，28（2）：423-426.
9	RODRIGUEZ CARVAJAL A， GRISHKOVSKAYA I， GOMEZ DIAZ C， et al. The linear ubiquitin chain assembly complex （LUBAC） generates heterotypic ubiquitin chains［J］. Elife， 2021， 10： e60660.
10	LIU J P， WANG Y L， GONG Y K， et al. Structural insights into SHARPIN-mediated activation of HOIP for the linear ubiquitin chain assembly［J］. Cell Rep， 2017， 21（1）： 27-36.
11	DRABER P， KUPKA S， REICHERT M， et al. LUBAC-recruited CYLD and A20 regulate gene activation and cell death by exerting opposing effects on linear ubiquitin in signaling complexes［J］. Cell Rep， 2015， 13（10）： 2258-2272.
12	JIMBO K， KOIDE S， ITO T， et al. Deficiency of the E3 ligase hoip impairs adult hematopoiesis and myeloid leukemia［J］. Blood， 2021， 138： 1153.
13	ELLIOTT P R， LESKE D， HRDINKA M， et al. SPATA2 links CYLD to LUBAC， activates CYLD， and controls LUBAC signaling［J］.Mol Cell，2016，63（6）： 990-1005.
14	TAKIUCHI T， NAKAGAWA T， TAMIYA H， et al. Suppression of LUBAC-mediated linear ubiquitination by a specific interaction between LUBAC and the deubiquitinases CYLD and OTULIN［J］. Genes Cells， 2014， 19（3）： 254-272.
15	SCHAEFFER V， AKUTSU M， OLMA M H， et al. Binding of OTULIN to the PUB domain of HOIP controls NF-κB signaling［J］. Mol Cell， 2014， 54（3）： 349-361.
16	DOUGLAS T， SALEH M. The plot thickens： OTULIN regulation in cell death［J］. Mol Cell Oncol， 2020， 7（4）： 1740541.
17	RITTINGER K， IKEDA F. Linear ubiquitin chains： enzymes， mechanisms and biology［J］. Open Biol， 2017， 7（4）： 170026.
18	BURNETT H， EMICH H， CARROLL C， et al. Epidemiological and clinical burden of EGFR Exon 20 insertion in advanced non-small cell lung cancer： a systematic literature review［J］.PLoS One，2021，16（3）： e0247620.
19	PONSIOEN B， POST J B， BUISSANT DES AMORIE J R， et al. Quantifying single-cell ERK dynamics in colorectal cancer organoids reveals EGFR as an amplifier of oncogenic MAPK pathway signalling［J］. Nat Cell Biol， 2021， 23（4）： 377-390.
20	JIANG Y H， LIM J， WU K C， et al. PAR2 induces ovarian cancer cell motility by merging three signalling pathways to transactivate EGFR［J］. Br J Pharmacol， 2021， 178（4）： 913-932.
21	LI T， TAO Z H， ZHU Y H， et al. Exosomal annexin A6 induces gemcitabine resistance by inhibiting ubiquitination and degradation of EGFR in triple-negative breast cancer［J］.Cell Death Dis，2021，12（7）： 684.
22	CHEN N， HAN X D， YIN B， et al. FGD5 facilitates tumor growth by regulating EGFR ubiquitination in gastric cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2021， 562： 43-49.
23	LI S， ZHENG X M， HU Y C， et al. RNF31 mediated ubiquitination of A20 aggravates inflammation and hepatocyte apoptosis through the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway［J］. Chem Biol Interact， 2021， 348： 109623.
24	ZHU J， ZHAO C， KHARMAN-BIZ A， et al. Correction： The atypical ubiquitin ligase RNF31 stabilizes estrogen receptor α and modulates estrogen-stimulated breast cancer cell proliferation［J］. Oncogene， 2019， 38（2）： 299-300.
25	NIU Z G， LI X， DONG S X， et al. The E3 ubiquitin ligase HOIP inhibits cancer cell apoptosis via modulating PTEN stability［J］. J Cancer， 2021， 12（21）：6553-6562.
26	ELLIOTT P R， NIELSEN S V， MARCO-CASANOVA P， et al. Molecular basis and regulation of OTULIN-LUBAC interaction［J］.Mol Cell， 2014， 54（3）： 335-348.
27	STANGL A， ELLIOTT P R， PINTO-FERNANDEZ A，et al. Regulation of the endosomal SNX27-retromer by OTULIN［J］. Nat Commun， 2019， 10（1）： 4320.

Primer	Sequence (5′－3′)
EGFR	F: AACACCCTGGTCTGGAAGTACG
	R: TCGTTGGACAGCCTTCAAGACC
β-actin	F: CACCATTGGCAATGAGCGGTTC
	R: AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT

[1]	李藤菲,王诗雨,蒋欣如,孙淼,李婷婷,林家锋,王颖,李永刚,陶晓莉. 纳尔逊湾正呼肠孤病毒非结构蛋白μNS和σNS表达特性的分析[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(4): 934-942.
[2]	王琴, 林春霖, 程志彬, 何若凡, 林鹏航, 陈辉, 叶建新, 朱广伟. 肿瘤坏死因子受体相关因子6泛素化位点突变载体的构建及其功能位泛素化位点的鉴定[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 551-558.
[3]	历程, 刘慧, 郭亮, 马云飞, 刘百龙, 董丽华. 放疗联合吉非替尼治疗EGFR敏感突变低级别肺黏液表皮样癌1例报告及文献复习[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(06): 1436-1439.
[4]	周红旭, 杜烨, 于云鹤, 韩冰, 李嗣杰, 郭国强, 范志民. 乳腺癌原发灶和同侧腋窝淋巴结转移灶中激素受体及Her-2表达差异及其对预后的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(02): 376-382.
[5]	于秀艳, 张晓伟, 野丽莉, 李铤, 刘晓峰, 吴雪峰. hMAM联合MMP-9和C-erbB2 mRNA表达检测在乳腺癌外周血微转移诊断中的应用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(05): 1009-1014.
[6]	刘相良, 纪伟, 李理, 赵颖华, 贾琳, 万志强, 陈晓, 李薇. 盐酸厄洛替尼片及耐药后化疗联合贝伐珠单抗注射液治疗肺腺癌1例报告并文献复习[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(05): 1019-1024.
[7]	李浩渤, 杜勇, 陈勇, 李文静. Notch 1对舌麟状细胞癌Tca8113细胞表皮生长因子受体表达的影响及其意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(04): 715-719.
[8]	张敏, 崔运芹, 宋焕芳, 吕建祎, 徐笑红, 高基民. 表皮生长因子受体对苯并芘诱导的人支气管上皮细胞SIRT1活化的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 731-736.
[9]	温剑平, 崔永生, 张雄基. 转染EGFRL858R的肺腺癌细胞中IL-6和VEGF表达水平及其意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(03): 502-505.
[10]	邵婉婷, 付彤, 武盼盼, 吴迪, 李嗣杰, 郑超, 范志民. Her-2阳性乳腺癌患者曲妥珠单抗联合新辅助化疗的效果评价及其预后影响因素分析[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(02): 351-357.
[11]	邹喜, 陈金梅, 洪金省, 郭飞宝, 蓝林臻, 张纬建. 非小细胞肺癌患者EGFR-TKI靶向治疗前后肿瘤体积变化规律及其临床价值[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(02): 345-350.
[12]	张宝月, 张俊农. 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼联合山奈酚诱导卵巢癌细胞凋亡的协同机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 31-35.
[13]	齐玲, 王玮瑶, 郑中华, 张以忠, 赵丽微, 钟秀宏, 赵东海, 杨淑艳, 杨宁江, 任旷, 于洪泉. SUMO及SUMO化修饰蛋白在恶性胶质瘤发生中的作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 7-10.
[14]	曹新梅，张岱权，王栩，夏纪毅，黄黎，高燕. C-erbB-2 shRNA对小鼠肺腺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(04): 777-781.
[15]	刘换新,白义凤,王炜,郭琳琅. LRIG1和 EGFR mRNA在非小细胞肺癌患者外周血中的表达及其临床意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(02): 363-368.