黄芪甲苷对脂多糖诱导的 MC3T3-E1细胞氧化损伤的保护作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20230101

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨黄芪甲苷（AS-Ⅳ）对脂多糖（LPS）诱导的成骨细胞前体细胞MC3T3-E1氧化损伤的保护作用，阐明其相关机制。方法将对数生长期MC3T3-E1细胞分为对照组、LPS组和不同浓度（10、25、50及100 mg·L^－1） AS-Ⅳ组，采用CCK-8法检测各组细胞活性。将对数生长期MC3T3-E1细胞分为对照组、LPS组、AS-Ⅳ组和AS-Ⅳ+LY294002［磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路抑制剂］组，采用流式细胞术检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，采用相关试剂盒检测各组细胞中丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中血红素加氧酶1（HO-1）mRNA表达水平，采用Western blotting法检测各组细胞中HO-1、PI3K、磷酸化Akt（p-Akt）、核因E2相关因子2（Nrf2）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达水平。结果 CCK-8法检测，与对照组比较，LPS组细胞活性明显降低（P<0.01）；与LPS组比较，50和100 mg?L^－1AS-Ⅳ组细胞活性明显升高（P<0.01）。与对照组比较，LPS组细胞中ROS和MDA水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）；与LPS组比较，AS-Ⅳ组细胞中ROS和MDA水平明显降低（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显升高（P<0.01）；与AS-Ⅳ组比较，AS-Ⅳ+LY294002组细胞中ROS和MDA水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）。与对照组比较，LPS组细胞中HO-1 mRNA表达水平和HO-1、p-Akt、Nrf2及Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.01），Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，AS-Ⅳ组细胞中HO-1 mRNA表达水平和HO-1、p-Akt、Nrf2及Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.01），Bax蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与AS-Ⅳ组比较，AS-Ⅳ+LY294002组细胞中和HO-1 mRNA表达水平和HO-1、p-Akt、Nrf2及Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.01），Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论 AS-Ⅳ可以通过介导PI3K/Akt/Nrf2信号通路对LPS诱导的成骨细胞氧化损伤起到保护作用。

关键词: 黄芪甲苷, 脂多糖, 成骨细胞, 氧化损伤

Abstract:

Objective To investigate the protective effect of astragaloside Ⅳ（AS-Ⅳ） on the lipopolysaccharide（LPS）-induced oxidative injury of osteoblasts precursor cells MC3T3-E1， and to clarify its related mechanism. Methods The MC3T3-E1 cells in logarithmic growth phase were divided into control group， LPS group and different concentrations （10，25，50 and 100 mg·L^－1） of AS-Ⅳ groups. CCK-8 method was used to detect the cell activities in various groups.The MC3T3-E1 cells in logarithmic growth phase were divided into control group， LPS group， AS-Ⅳ group， AS-Ⅳ+LY294002 ［phosphatidylinositol-3-kinase（PI3K）/protein kinase B（Akt）signaling pathway inhibitor］group. Flow cytometry was used to detect the levels of reactive oxygen species （ROS） in the cells in various groups. The levels of malondialdehyde （MDA） and glutathione（GSH） and the activities of superoxide dismutase（SOD） in the cells in various groups were determined with the related kits. The expression levels of heme oxygenase （HO-1） mRNA in the cells in various groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） method. Western blotting method was used to detect the expression levels of PI3K，phosphorylated Akt（p-Akt），and nuclear factor-E2 related factor 2（Nrf2），B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， and Bcl-2 associated X protein（Bax） in the cells in various groups. Results The CCK-8 method results showed that compared with control group， the cell activity in LPS group was significantly decreased （P<0.01）； compared with LPS group， the activities of cells in 50 and 100 mg·L^－1 AS-Ⅳ groups were significantly increased （P<0.01）. Compared with control group， the ROS and MDA levels in the cells in LPS group were significantly increased （P<0.01）， while the SOD activity and GSH level were decreased （P<0.01）； compared with LPS group， the ROS and MDA levels in the cells in AS-Ⅳ group were significantly decreased （P<0.01）， the SOD activity and GSH level were significantly increased （P<0.01）； compared with AS-Ⅳ group， the ROS and MDA levels in the cells in AS-Ⅳ+LY294002 group were significantly increased （P<0.01）， the SOD activity and GSH level were significantly decreased （P<0.01）. Compared with control group， the expression level of HO-1 mRNA and the expression levels of p-Akt， Nrf2， HO-1， and Bcl-2 proteins in the cells in LPS group were significantly decreased（P<0.01）， while the expression level of Bax protein was significantly increased （P<0.01）； compared with LPS group， the expression level of HO-1 mRNA and the expression levels of p-Akt， Nrf2， HO-1，and Bcl-2 proteins in the cells in AS-Ⅳ group were signicantly increased （P<0.01）， while the expression level of Bax protein was significantly decreased （P<0.01）；compared with AS-Ⅳ group， the expression level of HO-1 mRNA and the expression levels of p-Akt，Nrf2 HO-1 and Bcl-2 proteins in the cells in AS-Ⅳ+ LY294002 group were significantly decreased （P<0.01），and the expression level of Bax protein was significantly increased （P<0.01）. Conclusion AS-Ⅳ can play protective effect on the LPS-induced osteoblast injury by mediating PI3K/Akt/Nrf2 signaling pathway.

Key words: Astragaloside Ⅳ, Lipopolysaccharide, Osteoblast, Oxidative injury

中图分类号:

R285.5

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图/表 8

表1

表2

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Group	A value
Control	1.007±0.088
LPS AS-Ⅳ（mg·L^－1）	0.460±0.027^*
10	0.513±0.039
25	0.547±0.016
50	0.715±0.032^△
100	0.842±0.037^△

Group	ROS（η/%）	MDA	GSH	SOD
Control	30.870±1.856	1.000±0.037	1.000±0.070	1.000±0.015
LPS	57.730±0.603^*	1.762±0.074^*	0.458±0.023^*	0.376±0.024^*
AS-Ⅳ	34.600±0.964^△	1.282±0.083^△	0.828±0.079^△	0.904±0.045^△
AS-Ⅳ+LY294002	45.730±1.601^#	1.597±0.073^#	0.675±0.032^#	0.791±0.046^#

Group	HO-1	p-Akt	Nrf2
Control	1.000±0.043	1.000±0.060	1.000±0.027
LPS	0.593±0.043^*	0.480±0.034^*	0.280±0.019^*
AS-Ⅳ	0.850±0.045^△	0.843±0.046^△	0.921±0.032^△
AS-Ⅳ+LY294002	0.703±0.054^#	0.639±0.038^#	0.425±0.036^#

Group	Bcl-2	Bax
Control	1.000±0.028	1.000±0.072
LPS	0.372±0.023^*	3.346±0.139^*
AS-Ⅳ	0.553±0.028^△	2.122±0.075^△
AS-Ⅳ+LY294002	0.417±0.029^#	3.055±0.134^#

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