肿瘤坏死因子受体相关因子6泛素化位点突变载体的构建及其功能位泛素化位点的鉴定

doi:10.13481/j.1671-587X.20210303

摘要/Abstract

摘要： 目的

预测人肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）基因上的泛素化位点，并构建泛素化位点突变质粒，探讨突变质粒对人结直肠癌HCT116和SW480细胞中核因子κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1）相对荧光素酶活性的影响。

方法

采用UbPred、UbiSite和BDM-PUB软件预测TRAF6基因的泛素化位点，采用CE Design V1.04 软件设计突变引物，采用突变试剂盒进行定点突变，采用PCR法扩增获得突变后的目的片段，扩增产物经Dpnl酶消化，去除甲基化模板质粒，消化产物在Exnase Ⅱ催化作用下发生同源重组获得重组质粒；将重组质粒转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，对重组质粒进行DNA测序。采用双荧光素酶报告基因系统检测转染突变质粒后HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性。

结果

经过DNA测序，泛素化突变位点已经成功突变，泛素化突变质粒构建成功。与TRAF6野生型基因比较，转染第124、319和331位突变质粒后，结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低（P<0.05或P<0.01），其中转染第124位突变质粒后，结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低最明显（P<0.01）。

结论

成功构建人TRAF6基因的泛素化突变质粒，TRAF6的第124位氨基酸是其最重要的泛素化位点，可能影响下游信号通路中NF-κB和AP-1的活性。

Abstract: Objective

To predict the ubiquitination sites of human tumor necrosis factor receptor-associated factor 6（TRAF6） gene and construct the ubiquitination mutant plasmid， and to explore the effect of mutant plasmid on the relative luciferase activity of nuclear factor kappa-B（NF-κB）and activator protein-1（AP-1） in the human colorectal cancer HCT116 and SW480 cells.

Methods

UbPred， UbiSite， and BDM-PUB softwares were used to predict the ubiquitination sites of TRAF6 gene；the mutation primers were designed by CE Design V1.04 software， and the mutation kits were used for site-directed mutation； the mutated target fragment was amplified by PCR method；the amplified products were digested by Dpnl enzyme to remove the methylated template plasmids；the digested products were recombined under the catalysis of Exnase Ⅱ to obtain the recombinant plasmids；the recombinant plasmids were transformed into the competent cells of DH5α E. coli and the sequence was sequenced. The relative luciferase activities of NF-κB and AP-1 in the colorectal cancer HCT116 and SW480 cells were detected by dual-luciferase reporter gene system.

Results

After DNA sequencing， the ubiquitination mutation site was successfully mutated， and the ubiquitination mutant plasmid was successfully constructed. Compared with TRAF6 wild-type gene strain， the relative luciferase activities of NF-κB and AP-1 in the colorectal cancer HCT116 and SW480 cells were decreased after transfected with 124mut， 319mut， and 331mut plasmids （P<0.05 or P<0.01）， and the relative luciferase activities of NF-κB and AP-1 in the colorectal cancer HCT116 and SW480 cells were the most significantly decreased after transfected with 124mut plasmid（P<0.01）.

Conclusion

The ubiquitination mutant plasmids are successfully constructed.The 124th amino acid of TRAF6 is the most important ubiquitination site， which may affect the activities of NF-κB and AP-1 factors in downstream signaling pathways.

Key words: tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, mutant plasmid construction, ubiquitination, luciferase reporter system, nuclear factor kappa-B activator protein

中图分类号:

R735.3

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图/表 6

表1

图1

图2

图3

图 4

表2

参考文献

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Primer	Primer sequence (5'－3')
32mut-F	CGCTGTAACAgAAGATGATAGTGTGGGTGGAACTG
32mut-R	CATCTTcTGTTACAGCGCTACAGGAGCTGGCC
91mut-F	TAGGTTCTGCgAAGCCTGCATCATAAAATCAATAAGG
91mut-R	AGGCTTcGCAGAACCTATGGCCGCATGGCGTT
124mut-F	TGCAgAACGTGAGATTCTTTCTCTGATGGTGA
124mut-R	GAATCTCACGTTcTGCAAAATTGTCTGGAAATAGTTGA
319mut-F	CTGACTGCTgAAATGGAAACTCAGAGTATGTATGTAAGTG
319mut-R	TCCATTTcAGCAGTCAGCTCCCGGATTTGATG
331mut-F	AGTGAGCTCgAACGAACCATTCGAACCCTTGA
331mut-R	GTTCGTTcGAGCTCACTTACATACATACTCTGAGTTTC
371mut-F	AAGAGGAGgAACCTGTTGTGATTCATAGCCCTG
371mut-R	AACAGGTTcCTCCTCTTCTTGACATTTCAAATGC
384mut-F	TTCTACACTGGCgAACCCGGGTACAAACTGTGCA
384mut-R	GGTTcGCCAGTGTAGAATCCAGGGCTATGAAT
469mut-F	GGAACCCAgAAGGTTTTGGCTATGTAACTTTTATGC
469mut-R	AAAACCTTcTGGGTTCCGTGGGATTGTGGGTC

Plasmid	NF-κB		AP-1
Plasmid	HCT116	SW480	HCT116	SW480
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6	1	1	1	1
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6 32mut	1.01±0.08	1.04±0.11	1.07±0.05	0.99±0.16
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6 91mut	0.99±0.09	1.09±0.10	0.88±0.12	0.74±0.11
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6 124mut	0.34±0.02^**	0.25±0.14^**	0.27±0.01^**	0.33±0.07^**
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6 319mut	0.63±0.08^**	0.32±0.02^**	0.50±0.07^**	0.44±0.15^**
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6 331mut	0.68±0.05^*	0.54±0.03^*	0.60±0.04^**	0.54±0.01^*
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6 371mut	1.15±0.01	0.96±0.16	1.05±0.01	0.99±0.21
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6 384mut	1.10±0.09	0.98±0.03	1.14±0.10	1.01±0.16
pcDNA3.1-3×FLAG-TRAF6 460mut	0.99±0.09	1.01±0.11	0.99±0.02	0.91±0.10

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