利用pET-29b载体进行葡激酶基因表达与其产物的亲和纯化

doi:国家“九五”重点攻关项目资助课题

利用pET-29b载体进行葡激酶基因表达与其产物的亲和纯化

吴樱¹,黄鹤^1*,周加文²,甘一如¹

1. 天津大学化工学院生物工程系,天津300072；2. 吉林大学中日联谊医院妇产科,吉林长春130031

收稿日期:2004-07-28 修回日期:1900-01-01 出版日期:2004-11-28 发布日期:2004-11-28
通讯作者: 黄鹤

Expression and affinity purification of recombinantstaphylokinase using pET-29b vector

WU Ying¹, HUANG He^1*, ZHOU Jia-wen², GAN Yi-ru¹

1. Department of Bioengineering,School of Chemical Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,China-Japan Union Hospital， Jilin University, Changchun 100031, China

Received:2004-07-28 Revised:1900-01-01 Online:2004-11-28 Published:2004-11-28
Contact: HUANG He

摘要/Abstract

摘要： 目的：探讨6聚组氨酸序列与葡激酶基因序列融合表达及其表达产物的纯化方法。方法：将葡激酶的cDNA序列连入pET-29b质粒，转入E.coli BL21（DE3）进行表达。应用镍金属离子螯合层析及凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果：6聚组氨酸与葡激酶的可溶性融合蛋白在BL21（DE3）中的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的25％；螯合层析纯化后其纯度可达90％以上；再应用Sephacryl S-200HR可使其纯度提高到98％以上；测得其比活性为5.0×10⁴ AU•mg^-1。结论：利用pET-29b载体成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的亲和纯化。

关键词: 重组蛋白质类, 生物合成, 重组融合蛋白质类, 分离和纯化, 组氨酸, 色谱法, 亲和, 色谱法, 凝胶

Abstract: Objective To investigate the fusion expression of staphylokinase（SAK） gene with (His)₆-tag and the purification of the expression product with Ni²+- metal chelating affinity chromatography. Methods The fragment of SAK cDNA was inserted into the pET-29b expression plasmid and the recombinant vector pET-29b-SAK was transformed into E. coli BL21(DE3) which was then induced by IPTG. The recombinant SAK-(His)₆ was purified with His•Tag affinity chromatography, and its bioactivity was analyzed. Results SDS-PAGE analysis indicated that the soluble fusion protein occupied 25% of the total soluble proteins in BL21(DE3). By one-step metal chelating chromatography using Ni-IDA resin, the purity of rSAK-(His)₆ was more than 90%. Then the recombinant target product obtained greater than 98% purity by the sequent exclusion chromatography using Sephacryl S-200HR. The specific activity of rSAK-(His)₆ purified was more than 5.0×10⁴ AU•mg^-1.　 Conclusion rSAK-(His)₆ has been expressed and purified successfully using pET-29b vector.

Key words: recombinant fusion proteins, biosynthysis, recombinant fusion proteins, isolation & purification, histidine, chromatography, affinity, chromatography, gel

中图分类号:

吴樱,黄鹤,周加文,甘一如. 利用pET-29b载体进行葡激酶基因表达与其产物的亲和纯化[J]. J4, 2004, 30(6): 865-870.

WU Ying, HUANG He, ZHOU Jia-wen, GAN Yi-ru. Expression and affinity purification of recombinantstaphylokinase using pET-29b vector[J]. J4, 2004, 30(6): 865-870.

[1]	王晓宁, 赵震, 刘冰, 李凌波. 临床待输血患者RhE抗原和不规则抗体的检测及其临床意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(04): 801-805.
[2]	孙红, 李硕峰, 崔菁, 张二帅, 李景武, 熊艳杰, 马丽桃, 姚芳莲, 车鹏程. 木葡聚糖基温敏水凝胶预防大鼠腹壁-肠壁再粘连及其对局部TGF-β1和CTGF表达的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(02): 223-228.
[3]	王晓宁, 王震, 刘冰, 金玉顺, 张冬霞. 老年待输血患者Rh系统表型分型和不规则抗体检测及临床意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1143-1146.
[4]	王淑琴，崔东滨 . 心律宁胶囊中齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷浓度HPLC检测方法的建立及评价[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(02): 446-449.
[5]	甘振威，武广恒，刘国良，张娅婕，徐坤，谢林，甘露. 自动电位滴定法和高效液相色谱法测定深颜色果蔬中维生素C浓度的比较[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(02): 441-445.
[6]	刘竞研，尹建元，张大伟，杨玉霞，陈凡波，孙丹丹，孙振学，赵芸浩,孟勤. 参命源皂甙人参锭中人参皂苷浓度HPLC检测方法的建立及评价[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(02): 450-453.
[7]	王昊，崔巍巍，徐冰涵，于婷，章培标，刘娅. 二甲基砜/聚乙烯醇水凝胶的制备及其生物学特性评价[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(2): 396-399.
[8]	孙录\|史磊\|吕薇\|耿虹\|王华. HPLC法测定清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱含量方法的建立及评价[J]. J4, 2012, 38(5): 894-898.
[9]	刘守跃\|张影\|胡林森\|宋彬\|罗毅男\|关文明. 体外模拟脑缺血再灌注OGD/R模型的差异凝胶电泳分析[J]. J4, 2012, 38(5): 861-865.
[10]	孙聪\|韩业超\|吴强. 高效液相色谱法测定保元清血颗粒中黄芪甲苷含量方法的建立及评价[J]. J4, 2012, 38(4): 805-808.
[11]	潘颖\|方红娟\|钟磊\|李析蒨\|蔡知天\|宋波\|杜博. 微柱凝胶免疫检测方法检测血清CA125对卵巢上皮性恶性肿瘤的诊断价值[J]. J4, 2012, 38(1): 139-141.
[12]	刘银燕\|杨晓虹\|陈滴\|杨锦竹. 玉蜀黍叶中黄酮类成分的提取分离和结构鉴定[J]. J4, 2012, 38(1): 67-69.
[13]	伍贤军\|缪璇\|程秀\|王妍青\|辻一郎\|李晓萌. GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位[J]. J4, 2011, 37(6): 1024-1027.
[14]	邢雷\|潘奇正\|李云\|时佳宏\|李建会\|任治兴\|任淑萍. 硫酸锌对UVB致HaCaT细胞损伤的拮抗作用[J]. J4, 2011, 37(4): 646-650.
[15]	隋殿军, 董金香, 邱智东, 王维, 陈雪松, 董雪莲. 不同基源蜂胶中白杨素和高良姜素含量的比较[J]. J4, 2011, 37(4): 675-677.