骨髓间充质干细胞来源外泌体诱导自噬对MPP+抑制SH-SY5Y细胞存活的影响及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20220308

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源外泌体（Exo）诱导自噬对１-甲基-４-苯基吡啶离子（MPP⁺）抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞存活的影响，阐明其作用机制。

方法

将人神经细胞肿瘤SH-SY5Y细胞分别给予不同浓度（0、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol·L^－1）MMP⁺作用24和48 h后检测各组细胞存活率。实验分为对照组［给予磷酸盐缓冲液（PBS）］、MPP⁺组（给予0.50 mmol·L^－1 MPP⁺）、MPP⁺+BMSCs的上清液（BMSCs-Sup）组（给予0.50 mmol·L^－1 MPP⁺和BMSCs Sup）、MPP⁺+BMSCs-Exo组（给予0.50 mmol·L^－1 MPP⁺和100 mg·L^－1BMSCs Exo）、MPP⁺+雷帕霉素（Rap）组（给予0.50 mmol·L^－1 MPP⁺和2 mmol·L^－1Rap）和MPP⁺+BMSCs-Exo+3-甲基腺嘌呤（3-MA）组（给予0.50 mmol·L^－1 MPP⁺、100 mg·L^－1BMSCs-Exo和1 mmol·L^－1 3-MA）。MTT法检测各组SH-SY5Y细胞存活率，共聚焦显微镜下观察吖啶橙染色后各组SH-SY5Y细胞中自噬酸性囊泡荧光强度，Western blotting法检测各组细胞中CD63、TGS101和Calnexin蛋白表达情况。

结果

MTT检测，SH-SY5Y细胞存活率随着MPP⁺浓度的升高或处理时间的延长逐渐降低（P<0.05），且呈浓度和时间依赖性。与MPP⁺组比较，MPP⁺+BMSCs-Sup组、MPP⁺+BMSCs-Exo组和MPP⁺+Rap组SH-SY5Y细胞存活率升高（P<0.05）；与MPP⁺+BMSCs-Exo组比较，MPP⁺+BMSCs-Exo+3-MA组SH-SY5Y细胞存活率降低（P<0.05）。细胞吖啶橙染色，与MPP⁺组比较，MPP⁺+BMSCs-Sup组、MPP⁺+BMSCs-Exo组和MPP⁺+Rap组SH-SY5Y细胞中自噬酸性囊泡荧光强度增加（P<0.05）；与MPP⁺+BMSCs-Exo组比较，MPP⁺+BMSCs-Exo+3-MA组SH-SY5Y细胞中自噬酸性囊泡荧光强度降低（P<0.05）。Western blotting法检测，各组细胞中外泌体标志蛋白CD63和TGS101蛋白高表达，内质网标志蛋白Calnexin低表达。

结论

BMSCs-Exo通过激活细胞自噬抵抗MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞存活率下降。

关键词: 外泌体, 骨髓间充质干细胞, 自噬, 细胞存活率, SH-SY5Y细胞

Abstract: Objective

To investigate the effect of autophagy induced by exosomes （exo） derived from the bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） on the survival of the human neuroblastoma SH-SY5Y cells inhibited by 1-methyl-4-phenylpyridine ion （MPP⁺）， and to darify its mechanism.

Methods

The human neuroblastoma SH-SY5Y cells were given different concentrations（0，0.25，0.50，1.00，and 2.00 mmol·L^－1）MMP⁺，and the survival rates of the SH-SY5Y cells were detected after 24 and 48 h.The experiment was divided into control group［given phosphate buffered saline（PBS）］， 0.50 mmol·L^－1 MPP⁺group （given 0.50 mmol·L^－1 MPP⁺），MPP⁺+BMSCs supernatnt （BMSCs-Sup）group （given 0.50 mmol·L^－1MPP⁺+BMSCs-Sup），0.50 mmol·L^－1 MPP⁺+BMSCs-Exo group （given 0.50 mmol·L^－1 MPP⁺+100 mg·L^－1BMSCs-Exo），MPP⁺+rapamycin（Rap） group （given 0.50 mmol·L^－1MPP⁺+2 mmol·L^－1 Rap） and MPP⁺+BMSCs-Exo+3-methyladenine（3-MA） group（given 0.50 mmol·L^－1 MPP⁺+100 mg·L^－1BMSCs-Exo +1 mmol·L^－1 3-MA）. The survival rates of the SH-SY5Y cells in various groups were detected by MTT assay.The fluorescence intensities of autophagic acid vesicles in the SH-SY5Y cells in various groups were detected by acridine orange staining under confocal microscope.The expression levels of CD63， TGS101，and Calnexin proteins in the SH-SY5Y cells in various groups were detected by Western blotting method.

Results

The MTT assay results showed that the survival rates of the SH-SY5Y cells were decreased gradually with the increasing of the MPP⁺concentration or the extension of treatment time （P<0.05） in a concentration- and time-dependent manner. Compared with MPP⁺group， the survival rates of the SH-SY5Y cells in MPP⁺+ BMSCs-Sup group， MPP⁺+BMSCs-Exo group，and MPP⁺+ Rap group were increased （P<0.05）. Compared with MPP⁺+BMSCs-Exo group， the survival rate of the SH-SY5Y cells in MPP⁺+BMSCs-Exo + 3-MA group was decreased （P<0.05）.The acridine orange staining results showed that compared with control group， the fluorescence intensities of autophagic acid vesicles in the SH-SY5Y cells in MPP⁺+ BMSCs-Sup group， MPP⁺+BMSCs-Exo group and MPP⁺+ Rap group were increased （P<0.05）； compared with MPP⁺+BMSCs-Exo group， the fluorescence intensity of autophagic acid vesicles in the SH-SY5Y cells in MPP⁺+BMSCs-Exo + 3-MA group was decreased （P<0.05）.The Western blotting results showed that the exosome marker proteins CD63 and TGS101 were highly expressed， while the endoplasmic reticulum marker protein Calnexin was lowly expressed.

Conclusion

BMSCs-Exo can resist the MPP⁺-induced decreasing of the survival of the SH-SY5Y cells by activating the autophagy.

Key words: Exosomes, Bone marrow mesenchymal stem cells, Autophagy, Cell viability, SH-SY5Y cells

中图分类号:

R285.5

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图/表 15

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参考文献 16

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