肿瘤归巢肽-近红外荧光蛋白融合蛋白的制备及其荧光特性

doi:10.13481/j.1671-587X.20220611

摘要/Abstract

摘要：

目的构建肿瘤归巢肽（THPs）-近红外荧光蛋白（NIRFP）miRFP670- LyP1融合蛋白的原核表达载体，纯化融合蛋白，研究融合蛋白的近红外荧光特性。方法采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ对pmiRFP670-N1质粒和pET-28a质粒进行双酶切，构建pET-miRFP670原核表达载体，通过点突变引入LyP-1的DNA序列，构建重组表达载体pET-miRFP670-LyP1；将测序正确的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21细胞中，SDS-PAGE电泳法检测不同温度（16 ℃和37 ℃）、不同异丙基硫代半乳糖苷浓度（0.1、0.5和1.0 mmol·L^－1）诱导下融合蛋白原核表达量；采用Ni-NTA树脂亲和纯化融合蛋白，检测miRFP670-LyP1蛋白原核表达量；采用荧光显微镜观察乳腺癌4T1细胞中miRFP670-LyP1融合蛋白的细胞内吞形态表现。结果检测到长度约为5 343和973 bp的DNA条带，与pET-28a载体及miRFP670基因片段大小相符。DNA测序，LyP1序列成功插入至pET-miRFP670表达载体中。在16 ℃时miRFP670-LyP1融合蛋白的可溶性蛋白表达量较37 ℃时更高。采用Ni-NTA树脂纯化得到了高纯度的miRFP670-LyP1融合蛋白。荧光成像，miRFP670-LyP1融合蛋白可被乳腺癌4T1细胞高效内吞。结论成功构建了pET-miRFP670-LyP1原核表达载体，融合蛋白在低温（16 ℃）较常温（37 ℃）诱导的可溶性蛋白表达量更高，亲和层析得到了高纯度的融合蛋白，融合蛋白被乳腺癌4T1细胞高效内吞并显示出近红外荧光。

关键词: 近红外荧光蛋白, 肿瘤归巢肽, 融合蛋白, 原核表达, 细胞内吞

Abstract:

Methods The pmiRFP670-N1 plasmid and pET-28a plasmid were doubly digested with restriction endonucleases EcoR Ⅰ and Not Ⅰ to construct the pET-miRFP670 prokaryotic expression vector. The LyP-1 DNA sequence was introduced through point mutation to construct the recombinant expression vector pET-miRFP670-LyP1； the recombinant expression vector with correct sequence was transformed into the E.coli BL21 cells and the prokaryotic expression amounts of fusion proteins induced under different temperatures （16 ℃ and 37 ℃） and different concentrations of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）（0.1，0.5，and 1.0 mmol·L^－1） were detected by SDS-PAG electrophoresis； the fusion protein was purified by Ni-NTA resin affinity， and the prokaryotic expression amount of the miRFP670-LyP1 protein was detected； the endocytosis morphology of the miRFP670-LyP1 fusion protein in breast cancer 4T1 cells was observed under fluorescence microscope. Results The double digestion of recombinant plasmid showed that two DNA bands of about 5 343 and 973 bp were obtained， which was consistent with the sizes of the pET-28a vector and miRFP670 gene fragment. The DNA sequencing results showed that the LyP1 sequence was successfully inserted into the pET-miRFP670 expression vector. The soluble protein expression amount of miRFP670-LyP1 fusion protein was higher at 16 ℃ than that at 37 ℃. The miRFP670-LyP1 fusion protein with high purity was obtained by purification with Ni-NTA resin. The fluorescence imaging results showed that the miRFP670-LyP1 fusion protein could be efficiently endocytosed by the breast cancer 4T1 cells. Conclusion The prokaryotic expression vector pET-miRFP670-LyP1 is successfully constructed，the soluble protein expression amount of the fusion protein is higher at low temperature （16 ℃） than that at normal temperature （37 ℃）， and the fusion protein with high purity is obtained by affinity chromatography，and the fusion protein is efficiently endocytosed by the breast cancer 4T1 cells and displays near-infrared fluorescence. Objective To construct the prokaryotic expression vector of tumor homing peptide（THPs）-near-infrared fluorescent protein（NIRFP）-miRFP670 LyP1 fusion protein， and to purified fusion protein， and to investigate the near infrared fluorescence characteristics of the fusion protein.

Key words: Near-infrared fluorescent protein, Tumor homing peptide, Fusion protein, Prokaryotic expression, Endocytosis

中图分类号:

R394.3

杨馥旭,胡楠楠,郭冲,穆业腾,薛晗,范宇鑫,郭峰霖,关新刚. 肿瘤归巢肽-近红外荧光蛋白融合蛋白的制备及其荧光特性[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(6): 1455-1461.

Fuxu YANG,Nannan HU,Chong GUO,Yeteng MU,Han XUE,Yuxin FAN,Fenglin GUO,Xingang GUAN. Preparation of tumor homing peptides-near-infrared fluorescent protein miRFP670-LyP1 fusion protein and its fluorescence characteristics[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2022, 48(6): 1455-1461.

图/表 5

图1

图2

图3

图4

图5

参考文献 28

1	WEISSLEDER R. A clearer vision for in vivo imaging［J］. Nat Biotechnol， 2001， 19（4）： 316-317.
2	HALL C， VON GRABOWIECKI Y， PEARCE S P， et al. iRFP （near-infrared fluorescent protein） imaging of subcutaneous and deep tissue tumours in mice highlights differences between imaging platforms［J］. Cancer Cell Int， 2021， 21（1）： 247.
3	FILONOV G S， PIATKEVICH K D， TING L M，et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging［J］. Nat Biotechnol， 2011，29（8）： 757-761.
4	关新刚，苏维恒，于欣，等. Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性［J］. 吉林大学学报（医学版）， 2014， 40（4）： 725-728.
5	刘珊珊，彭亮，陈建林，等. 红色荧光蛋白mCherry在衣原体感染模型中的应用［J］. 中华微生物学和免疫学杂志， 2020， 40（12）： 950-957.
6	SHCHERBAKOVA D M， VERKHUSHA V V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging［J］. Nat Methods， 2013， 10（8）： 751-754.
7	PIATKEVICH K D， SUBACH F V， VERKHUSHA V V.Far-red light photoactivatable near-infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome［J］. Nat Commun， 2013， 4： 2153.
8	SHCHERBAKOVA D M， BALOBAN M， EMELYANOV A V， et al. Bright monomeric near-infrared fluorescent proteins as tags and biosensors for multiscale imaging［J］. Nat Commun， 2016， 7： 12405.
9	AN F F， CHEN N D， CONLON W J， et al. Small ultra-red fluorescent protein nanoparticles as exogenous probes for noninvasive tumor imaging in vivo ［J］. Int J Biol Macromol， 2020， 153： 100-106.
10	HERBERT F C， BROHLIN O R， GALBRAITH T， et al. Supramolecular encapsulation of small-ultrared fluorescent proteins in virus-like nanoparticles for noninvasive in vivo imaging agents［J］. Bioconjug Chem， 2020， 31（5）： 1529-1536.
11	吴娇，杨唐斌，柳长柏. 肿瘤归巢肽及其在肿瘤靶向治疗中的应用［J］. 海南医学， 2016， 27（1）： 82-84.
12	FOGAL V， ZHANG L L， KRAJEWSKI S， et al. Mitochondrial/cell-surface protein p32/gC1qR as a molecular target in tumor cells and tumor stroma［J］. Cancer Res， 2008， 68（17）： 7210-7218.
13	JIANG Y J， LIU S J， ZHANG Y， et al. Magnetic mesoporous nanospheres anchored with LyP-1 as an efficient pancreatic cancer probe［J］. Biomaterials， 2017， 115： 9-18.
14	REN Y， CHEUNG H W， VON MALTZHAN G，et al. Targeted tumor-penetrating siRNA nano complexes for credentialing the ovarian cancer oncogene ID4［J］. Sci Transl Med， 2012， 4（147）： 147ra112.
15	TIMUR S S， YALÇIN G， ÇEVIK Ö，et al. Molecular dynamics， thermodynamic， and mutational binding studies for tumor-specific LyP-1 in complex with p32［J］. J Biomol Struct Dyn， 2018， 36（5）： 1134-1144.
16	ZHANG X Q， HUANG Y M， SONG H L， et al. Inhibition of growth and lung metastasis of breast cancer by tumor-homing triple-bioresponsive nanotherapeutics［J］. J Control Release， 2020， 328： 454-469.
17	SONG N N， ZHAO L Z， XU X Y， et al. LyP-1-modified multifunctional dendrimers for targeted antitumor and antimetastasis therapy［J］. ACS Appl Mater Interfaces， 2020， 12（11）： 12395-12406.
18	HUANG X， YIN Y L， WU M， et al. LyP-1 peptide-functionalized gold nanoprisms for SERRS imaging and tumor growth suppressing by PTT induced-hyperthermia［J］. Chin Chem Lett， 2019， 30（6）： 1335-1340.
19	LV C， ZHANG T Y， LIN Y， et al. Transformation of viral light particles into near-infrared fluorescence quantum dot-labeled active tumor-targeting nanovectors for drug delivery［J］. Nano Lett， 2019， 19（10）： 7035-7042.
20	ZHENG F F， WANG C， MENG T T， et al. Outer-frame-degradable nanovehicles featuring near-infrared dual luminescence for in vivo tracking of protein delivery in cancer therapy［J］. ACS Nano， 2019， 13（11）： 12577-12590.
21	GODARD A， KALOT G， PLIQUETT J， et al. Water-soluble aza-BODIPYs： biocompatible organic dyes for high contrast in vivo NIR-II imaging［J］. Bioconjug Chem， 2020， 31（4）： 1088-1092.
22	COSCO E D， LIM I， SLETTEN E M. Photophysical properties of indocyanine green in the shortwave infrared region［J］. Chem Photo Chem， 2021， 5（8）： 727-734.
23	余梦，张子俊，朱国委，等. Ag₂S基近红外Ⅱ区荧光量子点的水相合成优化探究［J］. 化学学报，2021，79（10）： 1281-1285.
24	CHANG E， THEKKEK N， YU W W， et al. Evaluation of quantum dot cytotoxicity based on intracellular uptake［J］. Small， 2006， 2（12）： 1412-1417.
25	RODRIGUEZ E A， TRAN G N， GROSS L A， et al. A far-red fluorescent protein evolved from a cyanobacterial phycobiliprotein［J］. Nat Methods， 2016， 13（9）： 763-769.
26	RUMYANTSEV K A， SHCHERBAKOVA D M， ZAKHAROVA N I， et al. Minimal domain of bacterial phytochrome required for chromophore binding and fluorescence［J］. Sci Rep， 2015， 5： 18348.
27	WILSON A L， WILSON K L， BILANDZIC M， et al. Non-invasive fluorescent monitoring of ovarian cancer in an immunocompetent mouse model［J］. Cancers， 2018， 11（1）： 32.
28	段海潇，杨俊寒，王琳，等. 表达近红外荧光蛋白的结肠癌细胞系的建立［J］. 湖北工业大学学报， 2020， 35（5）： 71-74.

[1]	焦凤娟,刘俊杰,卢思维,姜东君. 重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(5): 1109-1115.
[2]	阳雪兰,曾雷. 基因融合与癌症发生发展关系及其致病机制的研究进展Research progress in relationship between gene fusion and cancer occurrence and development of its pathogenesis[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 527-532.
[3]	张旭,刘乃萌,马娇艳,林楠,孙珉丹. 线粒体分裂融合蛋白表达失衡在IgA肾病小鼠肾脏病理学变化中的作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(2): 284-291.
[4]	杨泽斌, 王明月, 陈丽, 刘宁, 王浩, 崔梅英, 方楷漪, 夏薇, 关新刚. 载阿霉素细胞膜纳米囊泡对黑色素瘤B16F10细胞的杀伤效应[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 905-910.
[5]	李时孟, 赵丽纯, 乔璐, 何成彦, 刘卓. ATP5B原核表达和单克隆抗体的制备及其鉴定[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(01): 184-189.
[6]	孙敏英, 周红月, 接晶, 谢飞, 翟瑞萍, 陈潭秀, 袁红艳, 台桂香. 胸腺肽α1诱导MUC1特异性Th2型免疫应答[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(02): 299-304.
[7]	李会敏, 伊焕发. 刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(06): 1109-1114.
[8]	霍云龙, 王春玉, 赵越. Mu2蛋白亚细胞结构定位及其相互作用蛋白的筛选[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1054-1058.
[9]	刘微, 姚杨, 马萧萧, 邓裕宣, 梅迪, 刘磊, 王会岩. 融合表达载体pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 642-647.
[10]	邵敏, 王新颖, 刘星, 王燕, 周鹤峰, 葛正龙. hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 59-63.
[11]	杨柳, 汪小菀, 王冰瑜, 宋润敏, 李江. GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备[J]. 吉林大学学报(医学版), 2015, 41(03): 656-661.
[12]	王茹燕, 彭琳. 阳离子聚合物介导的基因治疗细胞内途径和主要屏障研究进展[J]. 吉林大学学报(医学版), 2015, 41(01): 200-203.
[13]	赵金匣，王志平，陶燕，贺振华，郭琦，洪梅. 携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 [J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(06): 1149-1154.
[14]	关新刚，苏维恒，于欣，佟海滨，孙新. Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(04): 725-728.
[15]	王娟，谢飞，陈潭琇，孙霞霞，李琼书，台桂香. 超滤技术去除重组MUC1-MBP融合蛋白中内毒素的效果评价[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(03): 539-542.