miRNA-138-5p靶向抑制HIF-1α表达对乳腺癌MCF-7细胞顺铂耐药的逆转作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20210215

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨miRNA-138-5p过表达对人乳腺癌MCF-7细胞顺铂（DDP）耐药的影响，并阐明其可能机制。

方法

采用浓度梯度递增法诱导MCF-7细胞，建立DDP耐药细胞株MCF-7/DDP，再将miR-138-5p mimics或HIF-1α过表达质粒分别或同时转染至MCF-7/DDP细胞中。将细胞分为阴性对照组（NC组，转染miR-138-5p mimics阴性对照）、miR-138-5p mimics组（转染miR-138-5p mimics）、miR-138-5p mimics+Vector组（共转染miR-138-5p mimics和空载质粒）和miR-138-5p mimics+HIF-1α组（共转染miR-138-5p mimics和HIF-1α过表达质粒），另选未经任何转染的MCF-7/DDP细胞作为空白对照组。采用不同浓度（0、10、20、40、80和100 μmol·L^－1）DDP处理细胞24 h，MTT法检测细胞增殖活性，并计算半数抑制浓度（IC₅₀）和耐药指数（RI）；实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）法检测细胞中miR-138-5p和HIF-1α mRNA表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率；Western blotting法检测细胞中HIF-1α、P-gp和MRP1蛋白表达水平；采用TargetScan软件预测miR-138-5p与HIF-1α靶向结合位点，并采用双荧光素酶报告系统验证两者靶向关系。

结果

与亲本MCF-7细胞比较，耐药细胞株MCF-7/DDP对DDP的IC₅₀值明显升高（P<0.01），且RI值为5.72。与亲本MCF-7细胞比较，耐药细胞株MCF-7/DDP中miR-138-5p表达水平明显降低（P<0.01），而HIF-1α mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。与空白对照组或NC组比较，miR-138-5p mimics组细胞中miR-138-5p表达水平和细胞凋亡率明显升高（P<0.01），HIF-1α蛋白表达水平和细胞增殖活性明显降低（P<0.01）。双荧光素酶报告系统实验，与NC组比较，miR-138-5p mimics组野生型HIF-1α细胞中荧光素酶活性明显降低（P<0.01）。与miR-138-5p mimics+ Vector组比较，miR-138-5p mimics+HIF-1α组细胞增殖活性明显升高（P<0.05），细胞凋亡率明显降低（P<0.01），细胞中HIF-1α、P-gp和MRP1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。

结论

miRNA-138-5p通过靶向抑制HIF-1α表达和下调耐药相关蛋白P-gp和MRP1表达水平，增强MCF-7/DDP细胞对DDP的敏感性。

关键词: miR-138-5p, 缺氧诱导因子1α, 乳腺肿瘤, 细胞耐药

Abstract: Objective

To investigate the effect of miRNA-138-5p overexpression on cisplatin （DDP） resistance of the human breast cancer MCF-7 cells， and to elucidate its possible mechanism.

Methods

The MCF-7 cells were induced by concentration gradient increasing method to establish the DDP cell strain MCF-7/DDP.Then miR-138-5p mimics or hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α） overexpression plasmid were transfected into the MCF-7/DDP cells separately or simultaneously. The MCF/DDP cells were divided into negative control group（NC group，transfected with miR-138-5p mimics negative control），miR-138-5p mimics group（transfected with mir-138-4p mimics），miR-138-5p mimics+Vector group （transfected with miR-138-5p mimics and empty plasmid）and miR-138-5p mimics+HIF-1α group（tranfected with miR-138-5p mimics and HIF-1α overexpression plasmid）；and the other MCF-7/DDP cells without transfection were used as blank control group.The cells were treated with different concentrations （0， 10， 20， 40， 80 and 100 μmol·L^－1） of DDP for 24 h and the proliferation activity of cells was detected by MTT， and half inhibitory concentration （IC₅₀） and drug resistance index （RI） were calculated. The expression levels of miR-138-5p and HIF-1α mRNA in the cells were detected by Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR）； flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of cells； Western blotting method was used to detect the expression levels of HIF-1α，P-gp and MRP1 proteins in the cells. TargetScan software was used to predict the target binding sites of miR-138-5p and HIF-1α， and the dual luciferase reporter system was used to verify the targeting relationship between miR-138-5p and HIF-1α.

Results

The IC₅₀ of drug-resistant cell strain MCF-7/DDP for DDP was significantly higher than that of its parent MCF-7 cells （P<0.01）， and the RI value was 5.72. Compared with parental MCF-7 cells， the miR-138-5p expression level in drug-resistant cell strain MCF-7/DDP was markedly reduced （P<0.01）， while the HIF-1α mRNA and protein expression levels were significantly increased （P<0.01）. Compared with blank control group and NC group， the miR-138-5p expression level and apoptotic rate in miR-138-5p mimics group were significantly increased （P<0.01），while the HIF-1α protein expression level and the proliferation activity of cells were significantly decreased （P<0.01）. Compared with NC group， the luciferase activity of wild-type HIF-1α cells in miR-138-5p mimics group was markedly decreased （P<0.01）. Compared with miR-138-5p mimics+Vector group， the proliferation activity of cells in miR-138-5p mimics+HIF-1α group was significantly increased （P<0.05）， the apoptotic rate of cells was significantly decreased （P<0.01），and the expression levels of HIF-1α， P-gp and MRP1 proteins in the cells were significantly increased （P<0.05）.

Conclusion

miRNA-138-5p inhibits the expression of HIF-1α and down-regulates the expression levels of resistance-related proteins P-gp and MRP1， thereby enhances the sensitivity of MCF-7/DDP cells to DDP.

Key words: miR-138-5p, hypoxia inducible factor-1α, breast neoplamsms, drug resistance

中图分类号:

R737.9

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