利多卡因对帕金森模型PC12细胞的保护作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20220312

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨利多卡因在1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的帕金森病（PD）模型PC12细胞的保护作用，并阐明其可能的分子机制。

方法

CCK-8法确定不同浓度（0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mmol·L^－1）MPTP的最佳作用浓度和作用时间，CCK-8法确定不同浓度（0.001、0.010、0.100、0.200、0.400、0.600、0.800和1.000 g·L^－1）利多卡因最佳作用浓度和作用时间，Western blotting法进一步确定利多卡因最佳作用浓度。将PC12细胞分为对照组（不进行何处理）、MPTP组（给予0.8 mmol·L^－1 MPTP作用24 h）、MPTP+利多卡因组（给予0.8 mmol·L^－1 MPTP作用24 h后再给予0.6 g·L^－1 利多卡因作用6 h）、MPTP+利多卡因+DKK1组（给予0.8 mmol·L^－1 MPTP作用24 h后再给予0.6 g·L^－1利多卡因和100 μg·L^－1DKK1作用6 h）和MPTP+DKK1组（给予0.8 mmol·L^－1 MPTP作用24 h后再给予100 μg·L^－1 DKK1作用6 h）。流式细胞术检测各组PC12细胞中活性氧（ROS）水平，ELISA法检测各组PC12细胞上清中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中Wnt配体蛋白1（Wnt1）、β连环蛋白（β-catenin）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β） mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中Wnt1、β-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）蛋白表达水平。

结果

与对照组比较，MPTP组PC12细胞中ROS、IL-1β、IL-6和TNF-α水平及GSK-3β mRNA表达水平以及GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），而Wnt1、β-catenin mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与MPTP组比较，MPTP+ 利多卡因组PC12细胞中ROS、IL-1β、IL-6和TNF-α水平及GSK-3β mRNA表达水平以及GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），而Wnt1、β-catenin mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。

结论

利多卡因可显著降低PC12细胞中ROS的生成及抑制促炎性细胞因子的释放，同时还可显著下调凋亡蛋白caspase 3的表达，从而发挥对MPTP诱导的PD模型PC12细胞的保护作用，其作用机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词: 帕金森病, 利多卡因, 氧化应激, Wnt配体蛋白1, PC12细胞

Abstract: Objective

To investigate the protective effect of lidocaine on the PC12 cells in Parkinson’s disease（PD） model induced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，3， 6-tetrahydropyridine （MPTP）， and to elucidate its possible molecular mechanism.

Methods

CCK-8 method was used to determine the optimal concentration and time of MPTP with different concentrations （0.2， 0.4， 0.8， 1.6， and 3.2 mmol·L^－1）. CCK-8 method was used to determine the optimal concentration and time of lidocaine with different concentrations （0.001， 0.010， 0.100， 0.200， 0.400， 0.600， 0.800， and 1.000 g·L^－1）， and Western blotting method was used to further determine the optimal concentration of lidocaine. The PC12 cells were divided into control group， MPTP group（0.8 mmol·L^－1 MPTP for 24 h）， MPTP+ lidocaine group（given 0.8 mmol·L^－1 MPTP for 24 h， followed by 0.6 g·L^－1 lidocaine for 6 h）， MPTP+ lidocaine +DKK1 group（given 0.8 mmol·L^-1 MPTP for 24 h， followed by 0.6 g·L^－1 lidocaine and 100 μg·L^－1 DKK1 for 6 h）， and MPTP+DKK1 group（given 0.8 mmol·L^－1 MPTP for 24 h， followed by 100 μg·mL^－1 DKK1 for 6 h）. Flow cytometry was used to detect the levels of reactive oxygen species （ROS） in the PC12 cells in various groups. The expression levels of interleukin-1β（IL-1β）， interleukin-6（IL-6），and tumor necrosis factor-α（TNF-α） in supernatant of the PC12 cells in various groups were detected by ELISA assay；real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of Wnt ligand protein 1 （Wnt1），β-catenin，and glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β） mRNA in the PC12 cells in various groups.The expression levels of Wnt1， β-catenin， GSK-3β， phosphorylated GSK-3β （p-GSK-3β）， and cysteine aspartate protease 3 （caspase 3） proteins in the PC12 cells in various groups were detected by Western blotting method.

Results

Compared with control group， the levels of ROS， IL-1β， IL-6 and TNF-α，and the expression levels of GSK-3β mRNA， and the expression levels of GSK-3β， p-GSK-3β， caspase 3 proteins in the PC12 cells in MPTP group were significantly increased（P<0.05）， and the expression levels of Wnt1， β-catenin mRNA and proteins were significantly decreased（P<0.05）. Compared with MPTP group， the levels of ROS， IL-1β， IL-6， and TNF-α and the expression levels of GSK-3β mRNA， and the expression levels of GSK-3β， p-GSK-3β， and caspase 3 proteins in the PC12 cells in MPTP+lidocaine group were significantly decreased（P<0.05）， however， the expression levels of Wnt1 and β-catenin mRNA and proteins were significantly increased（P<0.05）.

Conclusion

Lidocaine can significantly reduce the production of ROS and inhibit the release of pro-inflammatory cytokines in the PC 12 cells， and also significantly down-regulate the expression of apoptotic protein caspase 3， thus playing a protective role in the MPTP-induced PD model PC12 cells； its mechanism may be related to the Wnt /β-catenin signaling pathway.

Key words: Parkinson’s disease, Lidocaine, Oxidative stress, Wnt ligand protein 1, PC12 cells

中图分类号:

R614.1

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图/表 12

表1

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参考文献 29

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Gene	Forward primer(5'-3')	Reverse primer(5'-3')
Wnt1	ACAGCGTTCATCTTCGCAATCACC	AAATCGATGTTGTCACTGCAGCCC
β-catenin	TCAGCTGTGTCCTGTGAA	CAGGTCAGCTTGAGTAGCCATT
GSK-3β	AGTGGTGAGAAGAAAGATGAGGT	AAGAGTGCAGGTGTGTCTCG
β-actin	TGTTACCAACTGGGACGAGA	CTTTTCACGGTTGGCCTTAG

Group	Wnt1	caspase 3
Control	0.360±0.010	0.537±0.007
MPTP	0.035±0.005^*	0.815±0.045^*
MPTP+0.200 g·L^－1 lidocaine	1.105±0.045^*△	0.755±0.005^*
MPTP+0.600 g·L^－1 lidocaine	1.575±0.055^*△#	0.660±0.020^△
MPTP+1.000 g·L^－1 lidocaine	0.630±0.008^*△#○	0.436±0.02^△#○
F	337.0	47.21
P	<0.01	<0.01

Group	ROS level
Control	1.215±0.005
MPTP	7.875±0.935^*
MPTP+lidocaine	1.47±0.050^△
MPTP+lidocaine+DKK1	3.005±0.035^*△#
MPTP+DKK1	4.390±0.090^*△#○
F	41.59
P	<0.01

Group	IL-1β	IL-6	TNF-α
Control	1.173±0.011	98.732±2.576	3.135±0.437
MPTP	1.935±0.083^*	172.561±1.053^*	24.421±1.578^*
MPTP+lidocaine	1.203±0.033^△	1005.020±4.722^△	6.081±1.387^△
MPTP+lidocaine+DKK1	2.122±0.003^*#	157.634±0.726^*#	33.186±0.240^*△#
MPTP+DKK1	2.834±0.011^*△#○	161.525±4.615^*#	29.030±0.530^*#
F	92.38	292.3	1916
P	<0.01	<0.01	<0.01

Group	Wnt1	β-catenin	GSK-3β	p-GSK-3β	caspase 3
Control	0.961±0.008	0.975±0.005	0.517±0.004	0.545±0.005	0.544±0.006
MPTP	0.563±0.011^*	0.408±0.004^*	0.568±0.008^*	0.772±0.014^*	0.580±0.010^*
MPTP+lidocaine	0.609±0.011^*△	0.476±0.010^*△	0.503±0.004^*△	0.419±0.004^*△	0.288±0.003^*△
MPTP+lidocaine+DKK1	0.399±0.008^*△#	0.340±0.010^*△#	0.729±0.010^*△#	0.519±0.005^△#	0.351±0.021^*△#
MPTP+DKK1	0.427±0.095^*△#	0.490±0.010^*△#	0.721±0.005^*△#	0.575±0.015^*△#	0.705±0.015^*△#○
F	690.2	2 325	342.5	190.6	209.5
P	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01