迷迭香酸通过激活Nrf2/HO-1通路对Aβ1-42所致星形胶质细胞损伤的保护作用

doi:10.13481/j.1671-587X.20230104

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨迷迭香酸（RA）对β淀粉样蛋白1-42（Aβ_1-42）引起的星形胶质细胞损伤的保护作用及炎症因子释放的抑制作用，并阐明其相关机制。方法原代培养星形胶质细胞，将细胞分为对照组，Aβ_1-42组（5 μmol?L^－1），不同浓度（20，50和100 μmol?L^－1）RA+Aβ_1-42组，核因子E2相关因子2（Nrf2）抑制剂（ML385）组，ML385+RA+Aβ_1-42组。星形胶质细胞以不同浓度（20、50和100 μmol?L^－1）RA预处理24 h，再给予终浓度5 μmol?L^－1Aβ_1-42处理24 h，ML385组在加入RA前先加入终浓度10 μmol?L^－1 ML385预处理6 h。MTT法检测各组细胞活性，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测各组细胞LDH释放率，酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测各组细胞中白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，Griess法检测各组细胞培养液中一氧化氮（NO）水平，免疫荧光法检测各组细胞中胶质原纤维酸蛋白（GFAP）和Nrf2表达情况，Western blotting法检测各组细胞中GFAP、Nrf2、血红素加氧酶1（HO-1）蛋白表达水平。结果与对照组比较，Aβ_1-42组细胞活性明显降低（P<0.01），LDH释放率及细胞中IL-1β、TNF-α和NO水平明显升高（P<0.01），GFAP荧光强度明显增强， Nrf2荧光强度明显减弱，细胞中GFAP蛋白表达水平明显升高（P<0.01），Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与Aβ_1-42组比较，不同浓度RA+Aβ_1-42组细胞活性明显升高（P<0.05或P<0.01），LDH释放率及细胞中IL-1β、TNF-α和NO水平明显降低（P<0.01），GFAP荧光强度明显减弱， Nrf2荧光强度明显增强，细胞中GFAP蛋白表达水平明显降低（P<0.01），Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与RA（50 μmol?L^－1）+Aβ_1-42组比较，ML385+RA+Aβ_1-42组细胞活性明显降低（P<0.01），LDH释放率及细胞中IL-1β、TNF-α和NO水平明显升高（P<0.01），GFAP荧光强度明显增强， Nrf2荧光强度明显减弱，细胞中GFAP蛋白表达水平明显升高（P<0.01），Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。结论 RA对Aβ_1-42诱导的星形胶质细胞炎症因子和NO释放有抑制作用，使星形胶质细胞免受损伤，该保护作用可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。

关键词: 迷迭香酸, 星形胶质细胞, β淀粉样蛋白, 核因子E2相关因子2, 血红素加氧酶1

Abstract:

Objective To investigate the protective effect of rosaminic acid （RA） on astrocyte injury induced by β-amyloid protein 1-42 （Aβ_1-42） and the inhibitory effect of the inflammatory factor release， and to clarify the related mechanism. Methods After primary culture，the astrocytes were divided into control group， Aβ_1-42 group （5 μmol?L^－1）， different concentrations（20，50，100 μmol?L^－1） of RA+Aβ_1-42 groups， nuclear factor E2-related factor 2（Nrf2） inhibitor ML385 group，and ML385+RA+Aβ_1-42 group.The astrocytes were pretreated with different concentrations （20，50，100 μmol·L^－1） of RA for 24 h and then treated with Aβ_1-42at a final concentration of 5 μmol·L^－1for 24 h，and the final concentration of 10 μmol·L^－1 ML385 was pretreated for 6 h before added RA in ML385 group. The cell activities in various groups were detected by MTT method， the lactate dehydrogenase（LDH）release rates of the cells in various groups were detected by LDH kits， the levels of interleukin-1β（IL-1β） and tumor necrosis factor-α（TNF-α） in the cells in various groups were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） kits， the levels of nitric oxide （NO） in culture medium in various groups were detected by Griess method， the expressions of glial fibrillary acidic protein （GFAP） and Nrf2 in the cells in various groups were detected by immunofluorescence method，and the expression levels of GFAP， Nrf2 and heme oxygenase-1 （HO-1） proteins in the cells in various groups were detected by Western blotting method. Results Compared with control group， the cell activity in Aβ_1-42group was significantly decreased（P<0.01）， the LDH release rate and the levels of IL-1β， TNF-α， and NO were significantly increased（P<0.01）， the fluorescence intensity of GFAP was significantly enhanced，the fluorescence intensity of Nrf2 was significantly reduced，the expression level of GFAP protein in the cells was significantly increased（P<0.01），and the expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins were significantly decreased （P<0.01）. Compared with Aβ_1-42 group， the cell activities in different concentrations of RA+Aβ_1-42 groups were significantly increased （P<0.01）， the LDH release rates and the levels of IL-1β，TNF-α， and NO were significantly decreased （P<0.01）， the fluorescence intensities of GFAP were significantly decreased，the fluorescence intensities of Nrf2 were significantly enhanced，the expression levels of GFAP protein were significantly decreased（P<0.01）， and the expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins were significantly increased （P<0.01）. Compared with RA （50 μmol?L^－1） +Aβ_1-42 group， the cell activity in ML385+Aβ_1-42+RA group was significantly decreased（P<0.01）， the LDH release rate and the levels of IL-1β， TNF-α， and NO were significantly increased（P<0.01）， the fluorescence intensity of GFAP was significantly enhanced，the fluorescence intensity of Nrf2 was significantly，the expression level of GFAP protein was significantly increased （P<0.01），and the expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins were significantly decreased （P<0.01）. Conclusion RA can inhibit the release of the inflammatory factors and NO， the mechanism of protecting astrocytes from damage may be related to the activation of Nrf2 / HO-1 pathway.

Key words: Rosmarinic acid, Astrocytes, β-amyloid protein, Nuclear factor E2-related factor 2, Heme oxygenase-1

中图分类号:

R742

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参考文献 23

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Group	A value
Control	0.61±0.03
Aβ_1-42	0.33±0.02^*
RA（20 μmol?L^－1）+Aβ_1-42	0.37±0.03^△
RA（50 μmol?L^－1）+Aβ_1-42	0.49±0.02^△△
RA（100 μmol?L^－1）+Aβ_1-42	0.56±0.02^△△
ML385	0.58±0.02
ML385+RA+Aβ_1-42	0.40±0.01^#

Group	LDH release rate
Control	15.33±3.22
Aβ_1-42	44.18±2.68^*
RA（20 μmol?L^－1）+Aβ_1-42	36.29±3.81^△
RA（50 μmol?L^－1）+Aβ_1-42	31.95±6.73^△
RA（100 μmol?L^－1）+Aβ_1-42	28.06±5.16^△
ML385	15.45±4.34
ML385+RA+Aβ_1-42	38.72±3.69^#

Group	IL-1β[ρ_B/(ng?L^－1)]	TNF-α[ρ_B/(ng?L^－1)]	NO[c_B/(μmol?L^－1)]
Control	10.71±0.13	2.75±0.36	6.86±0.24
Aβ_1-42	126.09±0.75^*	16.35±0.56^*	17.84±0.39^*
RA（20 μmol?L^－1）+Aβ_1-42	94.73±2.44^△	13.65±0.32^△	16.04±0.53^△
RA（50 μmol?L^－1）+Aβ_1-42	78.55±1.18^△	9.34±0.36^△	12.35±0.51^△
RA（100μmol?L^－1）+Aβ_1-42	64.05±1.24^△	7.17±0.31^△	8.81±0.36^△
ML385	11.98±0.46	3.51±0.30	7.79±0.82
ML385+RA+Aβ_1-42	97.35±1.67^#	13.51±0.88^#	16.35±0.83^#

Group	GFAP	Nuc-Nrf2	Cyt-Nrf2	HO-1
Control	0.21±0.01	0.77±0.02	0.92±0.01	0.54±0.03
Aβ_1-42	0.84±0.03^*	0.45±0.02^*	0.72±0.01^*	0.30±0.03^*
RA+Aβ_1-42	0.50±0.02^△	0.89±0.02^△	0.95±0.01^△	0.66±0.02^△
ML385	0.24±0.01	0.74±0.02	0.91±0.01	0.52±0.02
ML385+RA+Aβ_1-42	0.75±0.01^#	0.61±0.01^#	0.85±0.01^#	0.45±0.01^#

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