吉林大学学报(医学版) ›› 2023, Vol. 49 ›› Issue (6): 1528-1538.doi: 10.13481/j.1671-587X.20230616
摘要:
目的 探讨Klotho在子痫前期(PE)患者来源的胎盘外泌体(Exo)中的表达,阐明其对血管内皮细胞氧化应激的影响。 方法 收集40例孕产妇的临床资料,其中正常妊娠(NP)者20名,PE患者20例,设为NP组和PE组,分离2组研究对象外周血中胎盘Exo。将oe-Klotho和oe-NC质粒转染入人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo中,作为oe-Klotho组和oe-NC组,收集HTR-8/SVneo细胞Exo。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法和Western blotting法检测2组研究对象胎盘Exo和2组HTR-8/SVneo细胞Exo中Klotho mRNA及蛋白表达水平。取生长状态良好的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),按Exo来源不同将HUVECs分为PE-Exo组(与PE患者胎盘Exo共培养)、NP-Exo组(与NP胎盘Exo共培养)、oe-Klotho-Exo组(与转染oe-Klotho的HTR-8/SVneo细胞Exo共培养)和oe-NC-Exo组(与转染oe-NC的HTR-8/SVneo细胞Exo共培养)。采用透射电子显微镜(TEM)观察Exo形态表现,Western blotting法检测Exo标记分子CD63、TSG101和胎盘Exo标记分子PLAP蛋白表达水平以鉴定Exo,荧光显微镜观察HUVECs对Exo的摄取情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组HUVECs中一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性,RT-qPCR法检测各组HUVECs中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达水平,Western blotting法检测各组HUVECs中eNOS蛋白表达水平。 结果 与NP组比较,PE组患者收缩压和舒张压升高(P<0.05),新生儿体质量和胎盘质量均明显降低(P<0.05或P<0.01)。TEM观察,来源于NP组和PE组研究对象的胎盘Exo均呈圆形和椭圆形的囊泡盘状结构,包膜完整,形状相似,直径为50~100 nm;2组研究对象胎盘Exo均高表达Exo标记蛋白CD63和TSG101及胎盘Exo特异性蛋白PLAP。纳米示踪分析(NTA)检测,胎盘Exo的粒径为50~200 nm,提示由外周血分离的囊泡均是胎盘来源Exo。TEM、Western blotting和NTA检测,来源于oe-NC组和oe-Klotho组滋养层细胞的囊泡具有Exo的典型结构、分子标志物和粒径大小特征。HUVECs中均可见到明显的Exo绿色荧光表达,提示Exo可被HUVECs摄取。ELISA法检测,与NP-Exo组比较,PE-Exo组HUVECs中NO水平和SOD活性均明显降低(P<0.05或P<0.01),ROS和MDA水平明显升高(P<0.05或P<0.01);与oe-NC-Exo组比较,oe-Klotho-Exo组HUVECs中NO水平和SOD活性升高(P<0.05),ROS和MDA水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。RT-qPCR法检测,与NP组比较,PE组研究对象胎盘Exo中Klotho mRNA表达水平明显降低(P<0.01);与NP-Exo组比较,PE-Exo组HUVECs中eNOS mRNA表达水平明显降低(P<0.01);与oe-NC组比较,oe-Klotho组滋养层细胞Exo中Klotho mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与oe-NC-Exo组比较,oe-klotho-Exo组HUVECs中eNOS mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,与NP组比较,PE组研究对象胎盘Exo中Klotho蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与NP-Exo组比较,PE-Exo组HUVECs中eNOS蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与oe-NC组比较,oe-Klotho组滋养层细胞Exo中Klotho蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与oe-NC-Exo组比较,oe-Klotho-Exo组HUVECs中eNOS蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。 结论 来源于PE患者的胎盘Exo可能通过抑制HUVECs中NO的产生和促进氧化应激反应以损伤内皮细胞功能,过表达Klotho的滋养层细胞Exo可减少HUVECs中NO的产生和氧化应激水平。
中图分类号: