吉林大学学报(医学版) ›› 2023, Vol. 49 ›› Issue (4): 975-984.doi: 10.13481/j.1671-587X.20230419
Shan LIU1,Zhaodong XING2,Ping HUANG1()
摘要:
目的 分析结直肠癌细胞源性外泌体(Exo)中微小RNA-17-5p(miR-17-5p)表达对结直肠癌细胞化疗敏感性的影响,阐明其可能的作用机制。 方法 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测人结直肠癌HCT116细胞、CT26细胞、LoVo细胞、HT29细胞、SW620细胞、SW480细胞和人正常结肠直肠黏膜上皮HIEC细胞中miR-17-5p表达水平。CT26细胞分为对照组、miR-NC inhibitor组和miR-17-5p inhibitor组,提取各组细胞Exo,透射电子显微镜观察Exo形态表现,纳米粒子跟踪分析法检测粒径分布情况,Western blotting法检测Exo中标志蛋白CD9、CD63、凋亡诱导因子6互作蛋白(Alix)和肿瘤易感基因101(TSG101)蛋白表达水平,RT-qPCR法检测Exo中miR-17-5p表达水平。CT26细胞分为对照组、Exo组、Exo-miR-NC inhibitor组和Exo-miR-17-5p inhibitor组,分别以不同转染组CT26细胞源性Exo处理CT26细胞,Exo绿色荧光标记PKH67染料示踪法观察各组CT26细胞摄取Exo情况,MTT法检测1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和40.00 mg·L-1 5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理后各组CT26细胞增殖抑制率,流式细胞术检测各组CT26细胞凋亡率,细胞免疫荧光染色检测各组CT26细胞中微管相关蛋白轻链3B(LC3B)荧光强度,Western blotting法检测各组CT26细胞中微管相关蛋白轻链3 Ⅱ(LC3-Ⅱ)、微管相关蛋白轻链3Ⅰ(LC3-Ⅰ)、自噬效应蛋白Beclin-1和P62蛋白表达水平,并计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。 结果 人结直肠癌HCT116、CT26、LoVo、HT29、SW620和SW480细胞中miR-17-5p表达水平明显高于HIEC细胞(P<0.05);分离到的颗粒物呈典型球形囊泡,粒径峰值约140 nm,且CD9、CD63、Alix和TSG101蛋白均明显表达,表明成功分离到Exo。与对照组比较, miR-17-5p inhibitor组Exo中miR-17-5p表达水平明显降低(P<0.05)。与对照组比较,Exo组、Exo-miR-NC inhibitor组和Exo-miR-17-5p inhibitor组CT26细胞周围均可见明显的PKH67染色,显示CT26细胞可摄取Exo。与对照组比较,经1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和40.00 mg·L-15-Fu处理后Exo组CT26细胞增殖抑制率明显降低(P<0.05),各组CT26细胞凋亡率明显降低(P<0.05),细胞中LC3B荧光强度明显增强(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),P62蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与Exo组比较,经1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和40.00 mg·L-1 5-Fu处理后Exo-miR-17-5p inhibitor组CT26细胞增殖抑制率和细胞凋亡率明显升高(P<0.05),细胞中LC3B荧光强度减弱(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05),P62蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。 结论 抑制结直肠癌细胞源性Exo中miR-17-5p的表达可提高结直肠癌细胞的化疗敏感性,其作用机制可能与抑制细胞自噬水平有关。
中图分类号: