异钩藤碱上调miR-192-5p对TNF-α诱导的人支气管上皮细胞凋亡和炎症因子释放的作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20210308

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨异钩藤碱（IRN）对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人支气管上皮细胞（16HBE）凋亡和炎症因子释放的影响，并阐明其可能的作用机制。

方法

采用不同浓度［（0（对照组）、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 μmol·L^－1］IRN处理16HBE细胞24 h后，采用20 mg·L^－1 TNF-α处理细胞18 h。将16HBE细胞分为对照组、TNF-α组（20 mg·L^－1）、IRN组（20 μmol·L^－1）、TNF-α+IRN组（20 mg·L^－1 TNF-α和20 μmol·L^－1IRN）、TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor组（20 mg·L^－1 TNF-α、20 μmol·L^-1IRN和50 nmol·L^－1 miR-192-5p inhibitor）以及TNF-α+IRN+pcDNA3.1 CXCR5组［20 mg·L^－1 TNF-α、20 μmol·L^－1IRN和2 μmol·L^－1 pcDNA3.1-C-X-C趋化因子受体5（CXCR5）］。采用CCK-8法检测各组16HBE细胞活性，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组16HBE细胞中miR-192-5p和CXCR5 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组16HBE细胞中白细胞介素1β（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1）、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、CXCR5以及磷酸化的p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、c-Jun和核因子-κB（NF-κB）p65蛋白表达水平，ELISA法检测各组16HBE细胞上清液中IL-1β和MCP-1水平，流式细胞术检测各组16HBE细胞凋亡率，TargetScan7.1网站预测靶基因并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-192-5p与CXCR5之间的靶向结合关系。

结果

与对照组比较，不同浓度TNF-α组细胞活性明显降低（P<0.05）；与对照组组比较，5.0、10.0、20.0和30.0 μmol·L^－1 IRN组细胞活性升高（P<0.05）。与对照组比较，TNF-α组16HBE细胞中miR-192-5p和Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05），IL-1β、MCP-1、Cleaved-Caspase-3、p-p38、p-JNK、p-c-Jun和p-NF-κBp65蛋白表达水平，细胞凋亡率以及上清液中IL-1β和MCP-1水平明显升高（P<0.05）；与TNF-α组比较，TNF-α+IRN组16HBE细胞中miR-192-5p和Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05），IL-1β、MCP-1、Cleaved-Caspase-3、p-p38、p-JNK、p-c-Jun和p-NF-κBp65蛋白表达水平，细胞凋亡率以及上清液中IL-1β和MCP-1水平明显降低（P<0.05）；与TNF-α+IRN+NC inhibitor组比较，TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor组16HBE细胞中miR-192-5p和Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05），IL-1β、MCP-1、Cleaved-Caspase-3、p-p38、p-JNK、p-c-Jun和p-NF-κBp65蛋白表达水平，细胞凋亡率以及上清液中IL-1β和MCP-1水平明显升高（P<0.05）。与NC mimic和NC inhibitor组比较，miR-192-5p mimic组16HBE细胞中CXCR5 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05），miR-192-5p inhibitor组16HBE细胞中CXCR5 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与对照组比较，TNF-α组16HBE细胞中CXCR5蛋白表达水平明显升高（P<0.05），细胞活性明显降低（P<0.05），细胞凋亡率明显升高（P<0.05），上清液中IL-1β和MCP-1水平明显升高（P<0.05）；与TNF-α组比较，TNF-α+IRN组16HBE细胞中CXCR5蛋白表达水平明显降低（P<0.05），细胞活性明显升高（P<0.05），细胞凋亡率明显降低（P<0.05），上清液中IL-1β和MCP-1水平明显降低（P<0.05）；与TNF-α+IRN+ pcDNA3.1组比较，TNF-α+IRN+ pcDNA3.1 CXCR5组16HBE细胞中CXCR5蛋白表达水平明显升高（P<0.05），细胞活性明显降低（P<0.05），细胞凋亡率明显升高（P<0.05），上清液中IL-1β和MCP-1水平明显升高（P<0.05）。

结论

IRN能减轻TNF-α诱导的人支气管上皮细胞凋亡和炎症因子释放，其作用机制可能与miR-192-5p/MAPKs/ NF-κB信号通路有关。

关键词: 异钩藤碱, 慢性阻塞性肺疾病, 支气管上皮细胞, miR-192-5p, C-X-C趋化因子受体5

Abstract: Objective

To observe the effect of isorhynchophylline （IRN） on TNF-α-induced the apoptosis and the release of inflammatory factors in the human bronchial epithelial （16HBE） cells， and to explore its possible mechanism.

Methods

After treated with different concentrations［0（control group），2.5， 5.0， 10.0， 20.0， 30.0 and 40.0 μmol·L^－1］ of IRN for 24 h， the 16HBE cells were cultured with 20 mg·L^－1 TNF-α for 18 h. The 16HBE cells were divided into control group， TNF-α group （20 mg·L^－1）， IRN group （20 μmol·L^－1）， TNF-α+IRN group （20 mg·L^－1 TNF-α and 20 μmol·L^－1 IRN）， TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor group （20 mg·L^－1 TNF-α， 20 μmol·L^－1 IRN and 50 nmol·L^－1 miR-192- 5p inhibitor） and TNF-α+IRN+pcDNA3.1 CXCR5 group ［20 mg·L^－1 TNF-α， 20 μmol·L^－1 IRN and 2 μmol·L^－1 pcDNA3.1-C-X-C chomokine receptor type 5（CXCR5）］. CCK-8 method was used to detect the viabilities of 16HBE cells in various groups； Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of miR-192-5p and CXCR5 mRNA in the 16HBE cells in various groups；Western blotting method was used to detect the expression levels of interleukins-1β （IL-1β）and monocyte chemoattactant protein-1 （MCP-1），B cell lymphoma-2（Bcl-2）， Cleaved-Caspase 3， CXCR5， and phosphorylated p38（p-P38）， c-Jun N-terminal kinase （JNK）， c-Jun， and nuclear factor-κB （NF-κB） p65 proteins in the 16HBE cells in various groups； ELISA method was used to detect the levels of IL-1β and MCP-1 in supernatant of the 16HBE cells in various groups. TargetScan7.1 website was used to predict the target genes and the targeted binding association between miR-192-5p and CXCR5 was verified by dual-luciferase reporter gene assay.

Results

Compared with control group， the viability of the 16HBE cells in TNF-α group was significantly decreased （P<0.05）；compared with control group， the viabilities of 16HBE cells in 5.0，10.0，20.0， and 30.0 μmol·L^-1 IRN groups were increased （P<0.05）. Compared with control group， the expression levels of miR-192-5p and Bcl-2 proteins in the 16HBE cells in TNF-α group were significantly decreased （P<0.05）， the expression levels of IL-1β， MCP-1，Cleaved-Caspase-3， p-p38， p-JNK， p-c-Jun and p-NF-κB p65 proteins， the apoptotic rate and the levels of IL-1β and MCP-1 in supernatant of the 16HBE cells were significantly increased （P<0.05）； compared with TNF-α group， the expression levels of miR-192-5p and Bcl-2 protein in the 16HBE cells in TNF-α+IRN group were significantly increased （P<0.05）， the the expression levels of IL-1β， MCP-1，Cleaved-Caspase-3， p-p38， p-JNK， p-c-Jun and p-NF-κB p65 proteins， the apoptotic rate and the levels of IL-1β and MCP-1 in supernatant of the 16HBE cells were significantly decreased （P<0.05）； compared with TNF-α+IRN+NC inhibitor group， the expression levels of miR-192-5p and Bcl-2 protein in the 16HBE cells in TNF-α+IRN+ miR-192-5p inhibitor group were significantly decreased （P<0.05），the expression levels of IL-1β， MCP-1，Cleaved-Caspase-3， p-p38， p-JNK， p-c-Jun and p-NF-κB p65 proteins，and the apoptotic rate and the levels of IL-1β and MCP-1 in supernatant of the 16HBE cells were significantly increased （P<0.05）. Compared with NC mimic and NC inhibitor groups， the expression levels of CXCR5 mRNA and protein in the 16HBE cells in miR-192-5p mimic group were significantly decreased （P<0.05）， and the expression levels of CXCR5 mRNA and protein in the 16HBE cells in miR-192-5p inhibitor group were significantly increased （P<0.05）. Compared with control group， the expression level of CXCR5 protein in the 16HBE cells in TNF-α group was significantly increased （P<0.05）， the cell viability was decreased （P<0.05）， and the apoptotic rate and the levels of IL-1β and MCP-1 in supernatant of the 16HBE cells were increased （P<0.05）；compared with TNF-α group， the expression level of CXCR5 protein in the 16HBE cells in TNF-α+IRN group was significantly decreased （P<0.05），the cell viability was increased （P<0.05），and the apoptotic rate and the levels of IL-1β and MCP-1 were significantly decreased （P<0.05）； compared with TNF-α+IRN+ pcDNA3.1 group， the expression level of CXCR5 protein in the 16HBE cells in TNF-α+IRN+ pcDNA3.1 CXCR5 group was significantly increased （P<0.05），the cell viability was decreased （P<0.05），and the apoptotic rate and the levels of IL-1β and MCP-1 in supernatant of the 16HBE cells were increased （P<0.05）.

Conclusion

IRN can reduce the TNF-α-induced apoptosis and release of inflammatory factors in the human bronchial epithelial cells， and its mechanism may be related to the miR-192-5p/MAPKs/NF-κB signal pathway.

Key words: isorhynchophylline, chronic obstructive pulmonary disease, human bronchial epithelial cells, miR-192-5p, C-X-C chemokine receptor type 5

中图分类号:

侯从岭, 芦晓帆, 雷小婷, 李彬, 赵润杨. 异钩藤碱上调miR-192-5p对TNF-α诱导的人支气管上皮细胞凋亡和炎症因子释放的作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(3): 595-607.

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Group	IL-1β	MCP-1
Control	48.21±3.24	65.34±5.11
TNF-α	510.40±19.32^*	482.80±24.87^*
TNF-α+IRN	173.20±13.90^△	125.60±15.32^△
TNF-α+IRN+NC inhibitor	171.91±10.81	127.35±12.20
TNF-α+IRN+ miR-192-5p inhibitor	365.62±18.53^#	299.58±24.21^#

Group	p-p38/p38	p-JNK/JNK	p-c-Jun/c-Jun	p?NF?κB p65/ NF?κB p65
Control	1.00±0.09	1.00±0.05	1.00±0.06	1.00±0.06
TNF-α	3.51±0.15^*	2.64±0.10^*	2.23±0.08^*	2.41±0.18^*
TNF-α+IRN	2.38±0.12^△	1.59±0.16^△	1.24±0.03^△	1.54±0.14^△
TNF-α+IRN+NC inhibitor	2.35±0.07	1.65±0.11	1.21±0.06	1.49±0.09
TNF-α+IRN+ miR-192-5p inhibitor	3.14±0.07^#	2.29±0.06^#	1.56±0.09^#	1.97±0.02^#

Group	IL-1β	MCP-1
Control	52.17±3.53	70.68±5.08
TNF-α	497.15±14.89^*	511.57±27.24^*
TNF-α+IRN	154.32±13.24^△	182.11±15.68^△
TNF-α+IRN+pcDNA3.1	150.62±11.35	179.00±12.28
TNF-α+IRN+ pcDNA3.1 CXCR5	267.35±16.55^#	290.85±24.49^#

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