结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

doi:吉林省科技厅重点项目资助课题(20040401-5)

结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

史洪博，段秀梅，李树蕾，许淑芬，车媛媛，刘小林，刘力华，姜艳芳，方艳秋，谭岩^*

吉林大学第一医院中心实验室，吉林长春 130021

收稿日期:2006-02-27 修回日期:1900-01-01 出版日期:2006-11-28 发布日期:2006-11-28
通讯作者: 谭岩

Construction， expression, purfication and identification of prokaryotic expression plasmid of mycobacterium tuberculosis HSP70 protein

SHI Hong-bo, DUAN Xiu-mei, LI Shu-lei, XU Shu-fen, CHE Yuan-yuan, LIU Xiao-lin, LIU Li-hua, JIANG Yan-fang, FANG Yan-qiu, TAN Yan^*

Central Laboratory,First Hospital,Jinlin University,Changchun　130021,China

Received:2006-02-27 Revised:1900-01-01 Online:2006-11-28 Published:2006-11-28
Contact: TAN Yan

摘要/Abstract

摘要： 目的：构建结核分支杆菌HSP70原核表达载体并诱导其表达和纯化及鉴定目的蛋白。方法：利用PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增出Mtb HSP70 DNA序列，构建重组质粒pGEM-Mtb HSP70，经酶切、PCR和测序鉴定后，将Mtb HSP70基因亚克隆到原核表达质粒PQE30，构建重组表达质粒PQE30-Mtb HSP70，在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析的方法纯化目的蛋白，Western blotting杂交鉴定纯化蛋白。结果：经测序证实，获得的目的基因与GenBank中公布的结核杆菌Mtb HSP70基因序列一致。构建的原核表达载体PQE30-Mtb HSP70在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1 IPTG诱导后表达出相对分子质量约为70 400的蛋白，镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Western blotting,在相对分子质量约70 400处可见特异性着色带。结论：成功构建原核表达载体PQE30-Mtb HSP70，并成功诱导Mtb HSP70蛋白的表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的Mtb HSP70蛋白。

关键词: 结核, 热休克蛋白质70, 基因表达, 原核细胞, 蛋白质类∕分离与提纯

Abstract: Objective To clone the heat shock protein 70 (HSP70) gene of mycobacterium tuberculosis bovis,and construct prokaryotic plasmid of mycobacterium tuberculosis HSP70 (Mtb HSP70) and express it in E. coli,further more,to obtain high pure Mtb HSP70. Methods The whole Mtb HSP70 DNA sequence was amplified from mycobacterium tuberculosis bovis genome by polymerase chain reaction (PCR).Then the sequence was cloned into plasmid pGEM-T easy and sequenced. The recombinant expression plasmid PQE30-Mtb HSP70 was constructed and expressed in E.coli M15,and Mtb HSP70 was purified by Ni-NTA affinity chromatography column. Results The sequence of Mtb HSP70 was amplified and identical with that published in GenBank. The prokaryotic expresstion plasmid of Mtb HSP70 was constructed success fully.With induction of IPTG, a new fusion protein with relative molecular mass of 70 400 was expressed and mainly located in inclusion bodies,the expressed 6×his-Mtb HSP70 fusion proteins were identified by Western blotting with anti-His monoclonal antibody. Conclusion A  confirmed Mtb Hsp70 gene is cloned and expressed in E. coli successfully,and high pure Mtb HSP70 is obtained.

Key words: uberculosis , heat-shock proteins 70 , gene expression , prokaryotic cells, proteins, isolation and purfication

中图分类号:

史洪博，段秀梅，李树蕾，许淑芬，车媛媛，刘小林，刘力华，姜艳芳，方艳秋，谭岩. 结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化[J]. J4, 2006, 32(6): 989-992.

SHI Hong-bo, DUAN Xiu-mei, LI Shu-lei, XU Shu-fen, CHE Yuan-yuan, LIU Xiao-lin, LIU Li-hua, JIANG Yan-fang, FANG Yan-qiu, TAN Yan. Construction， expression, purfication and identification of prokaryotic expression plasmid of mycobacterium tuberculosis HSP70 protein[J]. J4, 2006, 32(6): 989-992.

[1]	陈炳鹏, 任明, 李容杭, 韩青, 王金成. 基因芯片技术检测NOB1对骨肉瘤细胞相关基因的调控作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(05): 929-934.
[2]	田丹, 孙新, 安晓婷, 张立岩, 刘杨, 佟海滨, 李坦, 申野, 满枋霖, 颜伟群. HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(05): 948-952.
[3]	刘红梅, 初喆, 田锐, 唐颖. IL-10和IL-12检测在结核性和恶性胸腔积液鉴别诊断中的应用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(04): 782-786.
[4]	辛桂杰, 朱海超, 李昊, 温剑平. 最低限度免疫定义基因表达的HCV多表位DNA疫苗对小鼠细胞免疫的诱导作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1071-1075.
[5]	冯晓朦, 王晶莹, 时景伟, 李威, 高申, 冯雪飞, 谢风. 血清ADA水平和T-spot.TB联合检测在肺结核诊断中的应用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(02): 306-310.
[6]	齐玲, 王玮瑶, 郑中华, 张以忠, 赵丽微, 钟秀宏, 赵东海, 杨淑艳, 杨宁江, 任旷, 于洪泉. SUMO及SUMO化修饰蛋白在恶性胶质瘤发生中的作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 7-10.
[7]	殷雨天, 张靓, 张越, 蒋玲玲, 王钰涵, 王瑞, 张鹏, 李波. 结核分枝杆菌痰培养阳性肺结核患者对一线抗结核药耐多药情况分析[J]. 吉林大学学报(医学版), 2015, 41(05): 1080-1084.
[8]	彭蔚, 黎友伦, 冯燕梅, 彭丽. gp10基因的原核表达及其联合异烟肼的体外抗结核菌活性[J]. 吉林大学学报(医学版), 2015, 41(03): 548-552.
[9]	吴文芳,邱金旭,卢丽敏,杨冬艳 . 甲状腺乳头状癌并发颈部淋巴结结核的超声影像学特征[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014, 40(04): 895-897.
[10]	刘姝，王霁雪,吴雅臻，王淑梅. 色素上皮源性因子基因转染对巨噬细胞诱导大鼠增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(6): 1181-1185.
[11]	孙晓宇，何钟勤，刘晓红，高心，钟丞，薛莹. 殊异韦荣菌sahH基因的克隆、表达和纯化[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(4): 704-709.
[12]	王丹妹，何佟，吉丽敏，林峰，林容，林堂昌，莫燕娜. 中国海南黎族人群LMP2/LMP7基因多态性与肺结核病的关联性[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(4): 786-790.
[13]	张雪，陈萍，毕云枫，曲宁宁，刘琼，孙鑫泽. 木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因的克隆与表达[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(4): 690-693.
[14]	李彤，张娟，张桂珍，徐江涛，张萍，蒋俊，孙秀华，杜珍武. TLR8基因多态性与中国东北地区汉族肺结核病的关联性分析[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 584-587.
[15]	贾晓辉，罗建民，刘亚平，尹婉宜，张丽红. SHIP和Caspase-3 mRNA在骨髓增生异常综合征患者骨髓组织中的表达及其临床意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 554-558.