miR-30a-5p靶向调控TRIM31表达对结直肠癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的逆转作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20210323

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨miR-30a-5p靶向三结构域蛋白31（TRIM31）基因对结直肠癌（CRC）细胞5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药的影响，并阐明其作用机制。

方法

收集27例5-FU化疗敏感（5-FU/S组）CRC患者和23例5-FU化疗耐药（5-FU/R组）CRC癌患者的CRC组织，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测癌组织中miR-30a-5p和TRIM31 mRNA表达水平，Pearson相关分析法分析miR-30a-5p和TRIM31 mRNA表达的相关性。体外培养人CRC 5-FU耐药细胞HT-29/5-FU细胞及其亲本HT-29细胞，MTT法检测2种细胞增殖活性并计算半数抑制浓度（IC₅₀）和耐药指数（RI），RT-qPCR法检测2种细胞中miR-30a-5p和TRIM31 mRNA表达水平，Western blotting法检测2种细胞中TRIM31蛋白表达水平。将HT-29/5-FU细胞分为空白对照组、mimics NC组（转染miR-30a-5p阴性对照mimics NC）、miR-30a-5p mimics组（转染miR-30a-5p mimics）、miR-30a-5p mimics+vector组（转染miR-30a-5p mimics和阴性对照空载体）和miR-30a-5p mimics+TRIM31组（转染miR-30a-5p mimics和TRIM31过表达载体）。RT-qPCR法检测各组HT-29/5-FU细胞中miR-30a-5p和RTIM31 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组HT-29/5-FU细胞中TRIM31蛋白表达水平，MTT法检测各组HT-29/5-FU细胞增殖活性，流式细胞术检测各组HT-29/5-FU细胞凋亡率，双荧光素酶报告基因系统验证miR-30a-5p与TRIM31的靶向关系。

结果

与5-FU/S组比较，5-FU/R组患者CRC组织中miR-30a-5p表达水平降低（P<0.01），TRIM31 mRNA表达水平升高（P<0.01），miR-30a-5p和TRIM31 mRNA表达水平呈负相关关系（R²=0.885，P<0.01）。与HT-29细胞比较，HT-29/5-FU细胞中miR-30a-5p表达水平降低（P<0.01），TRIM31 mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.01）。HT-29/5-FU细胞和HT-29细胞的IC₅₀值分别为（104.41±0.22）和（9.82±0.31）mg·L^－1，RI值为12.42。与空白对照组和mimics NC组比较，miR-30a-5p mimics组HT-29/5-FU细胞中miR-30a-5p表达水平升高（P<0.01），TRIM31蛋白表达水平降低（P<0.01），HT-29/5-FU细胞增殖活性明显降低（P<0.01），HT-29/5-FU细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。与miR-30a-5p mimics组比较，miR-30a-5p mimics+TRIM31组HT-29/5-FU细胞中TRIM31蛋白表达水平升高（P<0.01），HT-29/5-FU细胞增殖活性明显升高（P<0.01），HT-29/5-FU细胞凋亡率明显降低（P<0.01）。双荧光素酶报告基因系统证实TRIM31是miR-30a-5p的靶基因。

结论

miR-30a-5p通过靶向TRIM31基因表达增强CRC耐药细胞对5-FU的敏感性。

关键词: miR-30a-5p, 三结构域蛋白31, 结直肠肿瘤, 5-氟尿嘧啶, 化疗耐药

Abstract: Objective

To investigate the effect of miR-30a-5p on 5-fluorouracil （5-FU） resistant of colorectal cancer（CRC） cells by targeting tripartite motif-containing protein 31 （TRIM31） gene， and to clarify its mechanism.

Methods

The CRC tissue of 27 patients with 5-FU chemotherapy-sensitive colorectal cancer （5-FU/S group） and 23 patients with 5-FU chemotherapy-resistant colorectal cancer （5-FU/R group） were collected. The expression levels of miR-30a-5p and TRIM31 mRNA in CRC tissue of the patients were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） method； the correlation between miR-30a-5p and TRIM31 mRNA expressions was analyzed by Pearson correlation analysis.The human CRC 5-FU resistant cells HT-29/5-FU cells and its parent HT-29 cells were cultured in vitro. The proliferation activities of two kinds of cells were detected by MTT assay， and the median inhibitory concentration （IC₅₀） and drug resistance index （RI） were calculated； the expression levels of miR-30a-5p and TRIM31 mRNA in two kinds of cells were detected by RT-qPCR method；the expression levels of TRIM31 protein in two kinds of cells were detected by Western blotting method. The HT-29/5-FU cells were further divided into blank control group， mimics NC group， miR-30a-5p mimics group， miR-30a-5p mimics+vector group and miR-30a-5p mimics+TRIM31 group. The cells in blank control group were not transfected， the cells in miR-30a-5p mimics group were transfected with miR-30a-5p mimics， the cells in miR-30a-5p mimics+vector group were transfected with miR-30a-5p mimics and negative control of vector， and the cells in miR-30a-5p mimics+TRIM31 group were transfected with miR-30a-5p mimics and TRIM31 over-expression vector. The expression levels of miR-30a-5p and TRIM31 mRNA in the HT-29/5-FU cells in various groups were detected by RT-qPCR method； the expression levels of TRIM31 protein in the HT-29/5-FU cells in various groups were detected by Western blotting method； the proliferation activities of the HT-29/5-FU cells in various groups were detected by MTT method； the apoptotic rates of the HT-29/5-FU cells in various groups were detected by flow cytometry；the targeted relationship between miR-30a-5p and TRIM31 was verified by dual-luciferase reporter gene system.

Results

Compared with 5-FU/S group， the expression level of miR-30a-5p in cancer tissue of the patients in 5-FU/R group was decreased （P<0.01），and the expression level of TRIM31 mRNA was increased （P<0.01）. The expression levels of miR-30a-5p and TRIM31 mRNA were negatively correlated （R²=0.885，P<0.01）. Compared with HT-29 cells， the expression level of miR-30a-5p in the HT-29/5-FU cells was decreased （P<0.01），and the expression levels of TRIM31 mRNA and protein were increased （P<0.01）. The IC₅₀ values of HT-29/5-FU and HT-29 cells were （104.41±0.22） and （9.82±0.31） mg·L^－1， respectively， and the RI value was 12.42. Compared with blank control group or mimics NC group， the expression level of miR-30a-5p in the HT-29/5-FU cells in miR-30a-5p mimics group was increased （P<0.01）， the expression level of TRIM31 protein was decreased （P<0.01）， the proliferation activity of HT-29/5-FU cells was significantly decreased （P<0.01），and the apoptotic rate of HT-29/5-FU cells was significantly increased （P<0.01）. Compared with miR-30a-5p mimics group， the expression level of TRIM31 protein in the HT-29/5-FU cells in imiR-30a-5p mimics+TRIM31 group was increased （P<0.01）， the proliferation activity of HT-29/5-FU cells was significantly increased （P<0.01），and the apoptotic rate of HT-29/5-FU cells was significantly decreased （P<0.01）.The dual-luciferase reporter system results confirmed that TRIM31 was the target gene of miR -30a-5p.

Conclusion

Over-expression of miR-30a-5p enhances the sensitivity of the CRC drug-resistance cells to 5-FU by targeting the TRIM31 gene expression.

Key words: miR-30a-5p, tripartite motif-containing protein 31, colorectal neoplasms, 5-fluorouracil, chemoresistance

中图分类号:

R735.37

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参考文献

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